作者：鐘天映陳媛媛畢利軍
作者單位：中國科學院生物物理研究所結構與分子生物學，北京，100101
刊名：生物化學與生物物理進展2009，36(10)
摘要：
三位美國科學家(Elizabeth H.Blackbum，Carol W.Greider和Jack W.Szostak)因發現“端粒和端粒酶是如何保護染色體的”獲得了2009年的諾貝爾生理學或醫學獎，端粒是染色體末端的特殊結構，對染色體有保護作用，而端粒酶能合成端粒，使得端粒的長度和結構得以穩定，研究發現，端粒長度和端粒酶活性與細胞的壽命以及很多疾病發生直接相關。隨著研究的不斷深入，實現合理控制端粒的長度和端粒酶活性成為可能，這將有助于攻克醫學領域“癌癥、特定遺傳病和衰老”三個重要領域的難題，有望研究開發出潛在的新療法。
2009年10月5日，瑞典皇家科學院諾貝爾獎委員會宣布將2009年度諾貝爾生理學或醫學獎(TheNobel Prizein Physiology or Medicine)授予3位美國科學家伊麗莎白·布萊克本(Elizabeth H．Blackburn)，卡蘿爾·格雷德(Carol W．Greider)和杰克·紹斯塔克(Jack W．Szostak)，以表彰他們“發現端粒和端粒酶是如何保護染色體的”。在染色體的末端部分有一個像帽子一樣的特殊結構，這就是端粒(圖1)。Blackburn和Szostak發現端粒的一段特殊DNA序列能使染色體不被降解，而Greider和Blackburn則找到了幫助端粒合成的分子——端粒酶。他們的發現闡明了端粒酶的作用——使端粒的長度和結構得以穩定，從而保護染色體。細胞隨著端粒的變短而衰老，而當端粒酶的活性足以維護端粒的長度時，細胞將會延遲衰老。在癌細胞獲得永生性這一過程中，端粒酶的激活起了非常重要的作用。相反，一些遺傳病正是由于端粒酶的活性缺陷將導致細胞的損傷。正是由于三位科學家的開創性工作讓人們知道端粒和端粒酶不僅與染色體的特質和穩定性密切相關，而且還涉及細胞的衰老與損傷、癌癥的發生等方面。
1端粒和端粒酶的發現及其結構與功能研究
對端粒的研究可追溯到20世紀70年代初對DNA聚合酶特性的深入研究引申出的一個染色體復制問題。研究發現，染色體并沒有隨著復制后RNA引物的降解而縮短，其自然末端也沒有相互融合，這些都暗示可能存在一個特殊的結構來避免染色體縮短和相互融合的發生。在逐漸明晰了染色體末端特殊結構的概念之后，人們給了它一個專有名稱——端粒(telomere)。其實早在20世紀30年代，諾貝爾獎得主Hermnn Muller和Barbara Mcclimock已經觀測到染色體的末端結構在避免染色體之間的融合中起了重要的作用，從而猜測它可能有保護染色體的作用。1978年，Blackburn發現了富含小染色體的模式生物四膜蟲的端粒含有許多重復的5’-CCCCAA-3’六堿基序列，與此同時，Szostak發現微型染色體在導入酵母后會很快被降解這一現象，于是這兩位科學家將四膜蟲的CCCCAA序列偶聯到微型染色體上并導入酵母，結果發現這段端粒序列的加入使得微型染色體免受降解，從而證實了端粒對染色體的保護作用。進一步的研究發現，端粒可通過形成t-loop緊湊結構，或者與Shelterin等端粒保護蛋白結合，從而防止染色體降解、避免末端融合，進一步調節細胞生長。隨著體細胞的不斷增殖，端粒會逐漸縮短(圖2)，當端粒縮短至一定程度，細胞停止分裂，進入靜止狀態，故有人稱端粒為正常細胞的“分裂鐘”(mistosis clock)。端粒DNA序列既有高度的保守性，如原生動物、真菌、高等植物及高等動物中期序列都很相似，又有種屬特異性，如四膜蟲重復序列為GGGGTT，草履蟲為TTGGGG，人類和哺乳動物為TTAGGG。
在1984年報道酵母端粒序列的同時，Blackburn實驗室發現了一個有趣的現象：帶著四膜蟲端粒DNA的人工染色體導入到酵母后，被加上了酵母的端粒而不是四膜蟲的端粒序列。由于端粒是由重復序列組成的，當時人們普遍猜想同源重組是延伸端粒、補償染色體末端隱縮的機制。但是同源重組只能復制出更多自身的序列，為什么在四膜蟲端粒上加的是酵母的端粒序列而不是四膜蟲端粒本身的序列呢?難道酵母中存在專門的“酶”來復制端粒DNA?隨后，Blackburn實驗室用四膜蟲的核抽提液與體外的端粒DNA進行溫育，證明確實存在一種“酶”能延伸端粒DNA，這種酶后來被命名為“端粒酶”(telomerase)。之后，Morin從人宮頸癌細胞株HeLa中鑒定了端粒酶的存在，并證實它是一種核糖核蛋白。端粒酶通過引物特異識別位點，以自身RNA為模板，在染色體末端合成端粒DNA，使端粒得以延長，為后續DNA聚合酶合成完整的染色體提供了平臺(圖3)。
人類端粒酶主要由RNA成分(hTR)、端粒酶相關蛋白1(hTEP1)和催化亞單位(hTERT)三部分組成。hTR長約560 nt，其中有11個堿基(5’-CUAACCCUAA-3’)與人類端粒序列5’TTAGGG-3’互補。與此區互補的反義寡核苷酸能抑制端粒酶活性，而這段RNA的突變會導致端粒酶活性的改變。hTEP1的mRNA表達并不限于有端粒酶活性的組織和細胞系，各組織的水平差異與端粒酶的活性無關，因此，端粒酶活性表達并不是由TEP1決定的，但hTERT則是端粒酶活性所需要的。作為RNA依賴的DNA聚合酶，區別于一般的蛋白逆轉錄DNA聚合酶，hTERT可識別單鏈富含G的寡核苷酸引物，以其RNA組分的堿基為模板與端粒重復序列進行堿基互補配對，在合成、延伸堿基序列中起催化作用。Skordalakes和同事克隆了赤擬谷盜(Tribolium castaneum)的端粒酶TERT并收到了三維晶體結構。如圖4所示，TERT的晶體結構由三部分組成：RNA結合區(TRBD)、逆轉錄區(the reverse transcriptasedomain)和羧基末端延伸區(carboxy-terminalextension，CTE)。TRBD主要由螺旋組成，含有CP和T兩個保守區域，與單鏈和雙鏈RNA結合。逆轉錄區由α螺旋和β折疊組成，呈現像手指(Fingers)和手掌(Palm)形狀的結構。而CTE區由延長的螺旋組成，其表面有長的loop結構，這種新的二級結構折疊方式使CTE區成為TERT的“拇指”(Thumb)。此研究結果為揭示TERT與RNA合作合成DNA的過程提供了重要的結構信息，為根本性理解端粒酶及其潛在的醫療應用邁出了重要的一步。
2端粒與細胞衰老
細胞的復制期限被認為是由導致衰老的兩個機制決定，一個是累積的DNA損傷，另一個是端粒的進行性縮短。1973年，Olovnikov先提出關于端粒丟失同衰老的關系理論，認為由于末端復制而造成的端粒丟失很可能調節了細胞的壽命。Bodnar等通過激活端粒酶的活性，使端粒得以延長，從而延長了人類正常細胞的生命周期，有力證實了端粒與衰老的關系。在Werner綜合癥(一種罕見的人類早衰疾病)的研究中，已有多個證據表明了端粒異常與其緊密相關。Crabbe等認為，端粒異常是WRN細胞基因組不穩定的原因之一。Stewart的研究結果表明，是端粒單鏈懸垂的侵蝕而非整個端粒長度的變化，導致了衰老這種狀態。Michishita等研究了人類SIRT6，一種具有乙酰基轉移酶活性的染色質相關蛋白，它可調節端粒染色質，其缺失導致的異常端粒結構與Wemer綜合癥中的特征相似。端粒與衰老研究的不斷深入，為進一步了解衰老的分子機制，提供了重要的線索。
3端粒與DNA損傷應答
真核線性染色體端粒的化學構成和染色體內的損傷、斷裂DNA十分相似，然而DNA修復機器卻能夠將兩者區分，其中與端粒結合的Shelterin蛋白復合物起了關鍵的作用。Shelterin是由6個蛋白質——TRF1、TRF2、TIN2、RAP1、TPP1和POT1，組成的復合物，可使端粒DNA不被DNA損傷應答(DNA damage response，DDR)所識別。其中，蛋白TRF2和POT1l分別抑制由ATM和ATR介導的DDR途徑，從而避免應答的發生。隨著細胞的分裂，端粒逐漸變短，當縮短到一定程度時，將會激活ATM和ATR介導的DDR途徑，細胞死亡或進入衰老。
然而，許多研究表明，與DNA損傷應答相關的蛋白質出現在端粒上，并直接或間接參與端粒的維護。DNA雙鏈斷裂修復蛋白的缺陷，如ATM、Ku、DNA-PKcs、RAD51D、MRN復合物的缺陷，會導致端粒的錯誤代謝。因此，功能性端粒需要和DDR修復蛋白相互作用。總體來說，現在觀察到的端粒和DNA損傷修復途徑存在著兩極關系。一方面，正常端粒需要避免DNA損傷應答的激活。另一方面，端粒復制和保護又需要DDR相關蛋白的參與。
4端粒與腫瘤發生
正常情況下人類體細胞端粒酶的檢測結果是陰性的，但在400個腫瘤樣品中，85％以上能檢測到端粒酶的存在。細胞的端粒酶活性因某些原因被激活，使端粒不斷維持在一定的長度，細胞因此逃過死亡而成為無限增殖的細胞——腫瘤細胞。端粒酶活性與惡性腫瘤的這種密切關系，為腫瘤的診斷提供了有效的標志物。端粒酶是正常細胞轉變為腫瘤細胞的關鍵性物質，是抗腫瘤治療的重要靶點。而且，正常細胞與腫瘤組織中端粒酶的表達、端粒的長度和細胞動力學的差異，使得選擇端粒酶作為藥物靶標成為相對平安的治療手段。通過抑制端粒酶活性來治療腫瘤的研究進展迅速，其中長度為13-mer的寡核苷酸GRN163能與人類端粒酶RNA亞單位hTR互補結合，從而抑制端粒酶與端粒的結合，達到抑制端粒酶活性的效果，已經被應用于臨床。
5端粒與干細胞功能
端粒酶的表達對于維持干細胞自我更新能力和復制潛能具有重要意義。伴隨器官的老化，端粒縮短，而端粒酶的功能缺失突變又會加劇端粒縮短。造血干細胞在表達端粒酶的情況下，隨著年紀的增長其端粒仍然會丟失，但B細胞和T細胞的激活能上調端粒酶的活性，從而減少端粒的侵蝕甚至使端粒延長。患有先天性角化不良(dyskeratosis congenkal，DC)、特發性肺纖維化(idiopathicpulmonary fibrosis，IPF)和再生障礙性貧血(aplasticanemia)的病人其端粒酶發生突變會導致組織器官更新能力的過早喪失，其壽命也因此縮短。這些現象均表明端粒長度和端粒酶活性與干細胞的細胞周期緊密聯系，且直接影響干細胞的分化和自我更新的能力。
6展望
三位科學家的發現使我們了解到端粒不僅與染色體的個性特質和穩定性密切相關，而且還涉及細胞的壽命、衰老與死亡等等。同時我們也應認識到端粒和染色體等雖然與細胞老化有關，進而影響衰老，但并非僅有的因素，“生命衰老是一個非常復雜的進程，它有許多不同的影響因素，端粒僅僅是其中之一”。端粒和端粒酶的發現是有關人類衰老、癌癥和干細胞等研究的謎題拼圖中重要的一片，此發現使我們對細胞的理解增加了新的維度，清楚地顯示了疾病的機理，并將促使我們開發出潛在的新療法。
盡管已有越來越多的有關端粒與端粒酶的研究成果，但這一領域仍然存在著不少有待解決的問題。端粒與端粒保護蛋白質之間是如何相互協調從而維持端粒的結構；究竟是由于端粒縮短到一定程度還是某些特異的末端結構導致染色體的不穩定性；正常的發育過程中端粒酶是如何調控，而在腫瘤細胞中又是怎樣被激活的。隨著研究的不斷深入，端粒維護的機制將被更完善地闡述，針對衰老、癌癥、遺傳病的治療方法也會有進一步的改進。