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作者：鐘天映陳媛媛畢利軍
作者單位：中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所結(jié)構(gòu)與分子生物學(xué)，北京，100101
刊名：生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展2009，36(10)
摘要：
三位美國(guó)科學(xué)家(Elizabeth H.Blackbum，Carol W.Greider和Jack W.Szostak)因發(fā)現(xiàn)“端粒和端粒酶是如何保護(hù)染色體的”獲得了2009年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，端粒是染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，對(duì)染色體有保護(hù)作用，而端粒酶能合成端粒，使得端粒的長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)定，研究發(fā)現(xiàn)，端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性與細(xì)胞的壽命以及很多疾病發(fā)生直接相關(guān)。隨著研究的不斷深入，實(shí)現(xiàn)合理控制端粒的長(zhǎng)度和端粒酶活性成為可能，這將有助于攻克醫(yī)學(xué)領(lǐng)域“癌癥、特定遺傳病和衰老”三個(gè)重要領(lǐng)域的難題，有望研究開(kāi)發(fā)出潛在的新療法。
2009年10月5日，瑞典皇家科學(xué)院諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)宣布將2009年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)(TheNobel Prizein Physiology or Medicine)授予3位美國(guó)科學(xué)家伊麗莎白·布萊克本(Elizabeth H．Blackburn)，卡蘿爾·格雷德(Carol W．Greider)和杰克·紹斯塔克(Jack W．Szostak)，以表彰他們“發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶是如何保護(hù)染色體的”。在染色體的末端部分有一個(gè)像帽子一樣的特殊結(jié)構(gòu)，這就是端粒(圖1)。Blackburn和Szostak發(fā)現(xiàn)端粒的一段特殊DNA序列能使染色體不被降解，而Greider和Blackburn則找到了幫助端粒合成的分子——端粒酶。他們的發(fā)現(xiàn)闡明了端粒酶的作用——使端粒的長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)定，從而保護(hù)染色體。細(xì)胞隨著端粒的變短而衰老，而當(dāng)端粒酶的活性足以維護(hù)端粒的長(zhǎng)度時(shí)，細(xì)胞將會(huì)延遲衰老。在癌細(xì)胞獲得永生性這一過(guò)程中，端粒酶的激活起了非常重要的作用。相反，一些遺傳病正是由于端粒酶的活性缺陷將導(dǎo)致細(xì)胞的損傷。正是由于三位科學(xué)家的開(kāi)創(chuàng)性工作讓人們知道端粒和端粒酶不僅與染色體的特質(zhì)和穩(wěn)定性密切相關(guān)，而且還涉及細(xì)胞的衰老與損傷、癌癥的發(fā)生等方面。
1端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)與功能研究
對(duì)端粒的研究可追溯到20世紀(jì)70年代初對(duì)DNA聚合酶特性的深入研究引申出的一個(gè)染色體復(fù)制問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，染色體并沒(méi)有隨著復(fù)制后RNA引物的降解而縮短，其自然末端也沒(méi)有相互融合，這些都暗示可能存在一個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)來(lái)避免染色體縮短和相互融合的發(fā)生。在逐漸明晰了染色體末端特殊結(jié)構(gòu)的概念之后，人們給了它一個(gè)專(zhuān)有名稱(chēng)——端粒(telomere)。其實(shí)早在20世紀(jì)30年代，諾貝爾獎(jiǎng)得主Hermnn Muller和Barbara Mcclimock已經(jīng)觀測(cè)到染色體的末端結(jié)構(gòu)在避免染色體之間的融合中起了重要的作用，從而猜測(cè)它可能有保護(hù)染色體的作用。1978年，Blackburn發(fā)現(xiàn)了富含小染色體的模式生物四膜蟲(chóng)的端粒含有許多重復(fù)的5’-CCCCAA-3’六堿基序列，與此同時(shí)，Szostak發(fā)現(xiàn)微型染色體在導(dǎo)入酵母后會(huì)很快被降解這一現(xiàn)象，于是這兩位科學(xué)家將四膜蟲(chóng)的CCCCAA序列偶聯(lián)到微型染色體上并導(dǎo)入酵母，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這段端粒序列的加入使得微型染色體免受降解，從而證實(shí)了端粒對(duì)染色體的保護(hù)作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，端粒可通過(guò)形成t-loop緊湊結(jié)構(gòu)，或者與Shelterin等端粒保護(hù)蛋白結(jié)合，從而防止染色體降解、避免末端融合，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)。隨著體細(xì)胞的不斷增殖，端粒會(huì)逐漸縮短(圖2)，當(dāng)端粒縮短至一定程度，細(xì)胞停止分裂，進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)，故有人稱(chēng)端粒為正常細(xì)胞的“分裂鐘”(mistosis clock)。端粒DNA序列既有高度的保守性，如原生動(dòng)物、真菌、高等植物及高等動(dòng)物中期序列都很相似，又有種屬特異性，如四膜蟲(chóng)重復(fù)序列為GGGGTT，草履蟲(chóng)為T(mén)TGGGG，人類(lèi)和哺乳動(dòng)物為T(mén)TAGGG。
在1984年報(bào)道酵母端粒序列的同時(shí)，Blackburn實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象：帶著四膜蟲(chóng)端粒DNA的人工染色體導(dǎo)入到酵母后，被加上了酵母的端粒而不是四膜蟲(chóng)的端粒序列。由于端粒是由重復(fù)序列組成的，當(dāng)時(shí)人們普遍猜想同源重組是延伸端粒、補(bǔ)償染色體末端隱縮的機(jī)制。但是同源重組只能復(fù)制出更多自身的序列，為什么在四膜蟲(chóng)端粒上加的是酵母的端粒序列而不是四膜蟲(chóng)端粒本身的序列呢?難道酵母中存在專(zhuān)門(mén)的“酶”來(lái)復(fù)制端粒DNA?隨后，Blackburn實(shí)驗(yàn)室用四膜蟲(chóng)的核抽提液與體外的端粒DNA進(jìn)行溫育，證明確實(shí)存在一種“酶”能延伸端粒DNA，這種酶后來(lái)被命名為“端粒酶”(telomerase)。之后，Morin從人宮頸癌細(xì)胞株HeLa中鑒定了端粒酶的存在，并證實(shí)它是一種核糖核蛋白。端粒酶通過(guò)引物特異識(shí)別位點(diǎn)，以自身RNA為模板，在染色體末端合成端粒DNA，使端粒得以延長(zhǎng)，為后續(xù)DNA聚合酶合成完整的染色體提供了平臺(tái)(圖3)。
人類(lèi)端粒酶主要由RNA成分(hTR)、端粒酶相關(guān)蛋白1(hTEP1)和催化亞單位(hTERT)三部分組成。hTR長(zhǎng)約560 nt，其中有11個(gè)堿基(5’-CUAACCCUAA-3’)與人類(lèi)端粒序列5’TTAGGG-3’互補(bǔ)。與此區(qū)互補(bǔ)的反義寡核苷酸能抑制端粒酶活性，而這段RNA的突變會(huì)導(dǎo)致端粒酶活性的改變。hTEP1的mRNA表達(dá)并不限于有端粒酶活性的組織和細(xì)胞系，各組織的水平差異與端粒酶的活性無(wú)關(guān)，因此，端粒酶活性表達(dá)并不是由TEP1決定的，但hTERT則是端粒酶活性所需要的。作為RNA依賴(lài)的DNA聚合酶，區(qū)別于一般的蛋白逆轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶，hTERT可識(shí)別單鏈富含G的寡核苷酸引物，以其RNA組分的堿基為模板與端粒重復(fù)序列進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，在合成、延伸堿基序列中起催化作用。Skordalakes和同事克隆了赤擬谷盜(Tribolium castaneum)的端粒酶TERT并收到了三維晶體結(jié)構(gòu)。如圖4所示，TERT的晶體結(jié)構(gòu)由三部分組成：RNA結(jié)合區(qū)(TRBD)、逆轉(zhuǎn)錄區(qū)(the reverse transcriptasedomain)和羧基末端延伸區(qū)(carboxy-terminalextension，CTE)。TRBD主要由螺旋組成，含有CP和T兩個(gè)保守區(qū)域，與單鏈和雙鏈RNA結(jié)合。逆轉(zhuǎn)錄區(qū)由α螺旋和β折疊組成，呈現(xiàn)像手指(Fingers)和手掌(Palm)形狀的結(jié)構(gòu)。而CTE區(qū)由延長(zhǎng)的螺旋組成，其表面有長(zhǎng)的loop結(jié)構(gòu)，這種新的二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊方式使CTE區(qū)成為T(mén)ERT的“拇指”(Thumb)。此研究結(jié)果為揭示TERT與RNA合作合成DNA的過(guò)程提供了重要的結(jié)構(gòu)信息，為根本性理解端粒酶及其潛在的醫(yī)療應(yīng)用邁出了重要的一步。
2端粒與細(xì)胞衰老
細(xì)胞的復(fù)制期限被認(rèn)為是由導(dǎo)致衰老的兩個(gè)機(jī)制決定，一個(gè)是累積的DNA損傷，另一個(gè)是端粒的進(jìn)行性縮短。1973年，Olovnikov先提出關(guān)于端粒丟失同衰老的關(guān)系理論，認(rèn)為由于末端復(fù)制而造成的端粒丟失很可能調(diào)節(jié)了細(xì)胞的壽命。Bodnar等通過(guò)激活端粒酶的活性，使端粒得以延長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)了人類(lèi)正常細(xì)胞的生命周期，有力證實(shí)了端粒與衰老的關(guān)系。在Werner綜合癥(一種罕見(jiàn)的人類(lèi)早衰疾病)的研究中，已有多個(gè)證據(jù)表明了端粒異常與其緊密相關(guān)。Crabbe等認(rèn)為，端粒異常是WRN細(xì)胞基因組不穩(wěn)定的原因之一。Stewart的研究結(jié)果表明，是端粒單鏈懸垂的侵蝕而非整個(gè)端粒長(zhǎng)度的變化，導(dǎo)致了衰老這種狀態(tài)。Michishita等研究了人類(lèi)SIRT6，一種具有乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性的染色質(zhì)相關(guān)蛋白，它可調(diào)節(jié)端粒染色質(zhì)，其缺失導(dǎo)致的異常端粒結(jié)構(gòu)與Wemer綜合癥中的特征相似。端粒與衰老研究的不斷深入，為進(jìn)一步了解衰老的分子機(jī)制，提供了重要的線索。
3端粒與DNA損傷應(yīng)答
真核線性染色體端粒的化學(xué)構(gòu)成和染色體內(nèi)的損傷、斷裂DNA十分相似，然而DNA修復(fù)機(jī)器卻能夠?qū)烧邊^(qū)分，其中與端粒結(jié)合的Shelterin蛋白復(fù)合物起了關(guān)鍵的作用。Shelterin是由6個(gè)蛋白質(zhì)——TRF1、TRF2、TIN2、RAP1、TPP1和POT1，組成的復(fù)合物，可使端粒DNA不被DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response，DDR)所識(shí)別。其中，蛋白TRF2和POT1l分別抑制由ATM和ATR介導(dǎo)的DDR途徑，從而避免應(yīng)答的發(fā)生。隨著細(xì)胞的分裂，端粒逐漸變短，當(dāng)縮短到一定程度時(shí)，將會(huì)激活A(yù)TM和ATR介導(dǎo)的DDR途徑，細(xì)胞死亡或進(jìn)入衰老。
然而，許多研究表明，與DNA損傷應(yīng)答相關(guān)的蛋白質(zhì)出現(xiàn)在端粒上，并直接或間接參與端粒的維護(hù)。DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白的缺陷，如ATM、Ku、DNA-PKcs、RAD51D、MRN復(fù)合物的缺陷，會(huì)導(dǎo)致端粒的錯(cuò)誤代謝。因此，功能性端粒需要和DDR修復(fù)蛋白相互作用。總體來(lái)說(shuō)，現(xiàn)在觀察到的端粒和DNA損傷修復(fù)途徑存在著兩極關(guān)系。一方面，正常端粒需要避免DNA損傷應(yīng)答的激活。另一方面，端粒復(fù)制和保護(hù)又需要DDR相關(guān)蛋白的參與。
4端粒與腫瘤發(fā)生
正常情況下人類(lèi)體細(xì)胞端粒酶的檢測(cè)結(jié)果是陰性的，但在400個(gè)腫瘤樣品中，85％以上能檢測(cè)到端粒酶的存在。細(xì)胞的端粒酶活性因某些原因被激活，使端粒不斷維持在一定的長(zhǎng)度，細(xì)胞因此逃過(guò)死亡而成為無(wú)限增殖的細(xì)胞——腫瘤細(xì)胞。端粒酶活性與惡性腫瘤的這種密切關(guān)系，為腫瘤的診斷提供了有效的標(biāo)志物。端粒酶是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞的關(guān)鍵性物質(zhì)，是抗腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。而且，正常細(xì)胞與腫瘤組織中端粒酶的表達(dá)、端粒的長(zhǎng)度和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的差異，使得選擇端粒酶作為藥物靶標(biāo)成為相對(duì)平安的治療手段。通過(guò)抑制端粒酶活性來(lái)治療腫瘤的研究進(jìn)展迅速，其中長(zhǎng)度為13-mer的寡核苷酸GRN163能與人類(lèi)端粒酶RNA亞單位hTR互補(bǔ)結(jié)合，從而抑制端粒酶與端粒的結(jié)合，達(dá)到抑制端粒酶活性的效果，已經(jīng)被應(yīng)用于臨床。
5端粒與干細(xì)胞功能
端粒酶的表達(dá)對(duì)于維持干細(xì)胞自我更新能力和復(fù)制潛能具有重要意義。伴隨器官的老化，端粒縮短，而端粒酶的功能缺失突變又會(huì)加劇端粒縮短。造血干細(xì)胞在表達(dá)端粒酶的情況下，隨著年紀(jì)的增長(zhǎng)其端粒仍然會(huì)丟失，但B細(xì)胞和T細(xì)胞的激活能上調(diào)端粒酶的活性，從而減少端粒的侵蝕甚至使端粒延長(zhǎng)。患有先天性角化不良(dyskeratosis congenkal，DC)、特發(fā)性肺纖維化(idiopathicpulmonary fibrosis，IPF)和再生障礙性貧血(aplasticanemia)的病人其端粒酶發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致組織器官更新能力的過(guò)早喪失，其壽命也因此縮短。這些現(xiàn)象均表明端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性與干細(xì)胞的細(xì)胞周期緊密聯(lián)系，且直接影響干細(xì)胞的分化和自我更新的能力。
6展望
三位科學(xué)家的發(fā)現(xiàn)使我們了解到端粒不僅與染色體的個(gè)性特質(zhì)和穩(wěn)定性密切相關(guān)，而且還涉及細(xì)胞的壽命、衰老與死亡等等。同時(shí)我們也應(yīng)認(rèn)識(shí)到端粒和染色體等雖然與細(xì)胞老化有關(guān)，進(jìn)而影響衰老，但并非僅有的因素，“生命衰老是一個(gè)非常復(fù)雜的進(jìn)程，它有許多不同的影響因素，端粒僅僅是其中之一”。端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)是有關(guān)人類(lèi)衰老、癌癥和干細(xì)胞等研究的謎題拼圖中重要的一片，此發(fā)現(xiàn)使我們對(duì)細(xì)胞的理解增加了新的維度，清楚地顯示了疾病的機(jī)理，并將促使我們開(kāi)發(fā)出潛在的新療法。
盡管已有越來(lái)越多的有關(guān)端粒與端粒酶的研究成果，但這一領(lǐng)域仍然存在著不少有待解決的問(wèn)題。端粒與端粒保護(hù)蛋白質(zhì)之間是如何相互協(xié)調(diào)從而維持端粒的結(jié)構(gòu)；究竟是由于端粒縮短到一定程度還是某些特異的末端結(jié)構(gòu)導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定性；正常的發(fā)育過(guò)程中端粒酶是如何調(diào)控，而在腫瘤細(xì)胞中又是怎樣被激活的。隨著研究的不斷深入，端粒維護(hù)的機(jī)制將被更完善地闡述，針對(duì)衰老、癌癥、遺傳病的治療方法也會(huì)有進(jìn)一步的改進(jìn)。