作者：褚啟龍楊克敵王愛國
華中科技大學同濟醫學院公共衛生學院，武漢，430030
摘要：
大量研究表明，氧化應激可導致細胞凋亡。目前對這一現象有四種解釋：ROS活化核轉錄因子KB并誘導核轉錄因子-κB表達，導致細胞凋亡；線粒體介導的細胞凋亡；ROS導致DNA損傷，激活P53誘導細胞凋亡及ROS激活SAPK通路介導細胞凋亡。但從總體上看，其分子機制還不十分清楚，有待進一步研究。
機體在有氧代謝過程中產生的活性氧族(reactive oxygenspecies，ROS)主要包括O2-、OH、H2O2、HOCl、NO、O3和單線態氧等，對大多數細胞都具有毒性作用。在正常情況下，機體內ROS的產生和ROS清除系統處于動態平衡狀態。由于種種原因，導致ROS產生增多或/和機體清除ROS能力的下降，機體就會出現氧化應激(oxidative stress)。當機體處于氧化應激狀態時，體內組織細胞ROS量相對升高，超過機體的清除能力，可導致機體組織脂質過氧化水平升高，引起DNA氧化損傷和蛋白質的表達異常，對機體造成損害。氧化應激使機體處于易損狀態，同時能增強致病因素的毒性作用，可導致基因突變，它不僅與多種疾病的發生發展有關，也與細胞凋亡存在著十分密切的關系。
細胞凋亡(apoptosis)是維持正常組織形態和一定功能的主動自殺過程，是在基因控制下按照一定程序進行的細胞死亡，故又稱為程序性細胞死亡(programmed cell death，PCD)。凋亡細胞具有典型的形態學改變，主要表現為細胞膜出現囊泡、細胞皺縮、核固縮、DNA有序片段化等。細胞凋亡是機體的一種生理機制，在維護機體內環境穩定方面發揮著重要的作用，但細胞凋亡過高或過低都會對機體產生不利的影響。
1氧化應激與細胞凋亡的關系
氧分子作為氧化磷酸化的終末電子受體，在需氧代謝中占有重要地位，但這種對電子需求的同時也導致了各種活性氧的形成，如O2-、OH及具有氫抽提能力的H2O2、HOCl等。ROS可啟動一個鏈式反應，易與細胞膜上的各種不飽和脂肪酸及膽固醇反應，這種直接作用于細胞的氧化損傷能導致細胞凋亡。但生物體在進化的過程中具備有效的抗ROS防御體系，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)及抗氧化物質(如維生素C、維生素E)等，因此，機體代謝耗氧的同時常伴有ROS的形成，細胞的功能狀態取決于ROS與抗氧化能力的平衡。
1．1外源性活性氧誘導細胞凋亡
1991年，Lennon等發現低濃度的H2O2(10～100μmol/L)可誘導HL-60細胞凋亡，當H2O2濃度繼續增高時，便可導致大量的細胞壞死。隨后有學者用5μmol/L H2O2作用于胸腺細胞，8h后發現35％的細胞發生凋亡，當H2O2濃度達到100μmol/L時，凋亡細胞達42％。高穎等用300μmol/L H2O2作用于人慢性髓細胞白血病細胞(K652細胞)，發現細胞核固縮、核破裂，FCM-DNA檢測在G0/G1峰前存在一低DNA含量“凋亡峰”，DNA電泳顯示間隔180～200bp的梯形圖譜。近期，Ishisaka等在用H2O2(10～50μmol/L)誘導HL-60細胞凋亡的過程中觀察到DNA斷裂，并發現線粒體釋放CytC和caspase-3被激活；當H2O2濃度達50μmol/L時，溶酶體明顯不穩定。Ishisaka根據大量的研究報道及自己的研究成果提出，H2O2是一種細胞凋亡介質。此外，氧化的低密度脂蛋白(OxLDL)能誘導淋巴細胞發生凋亡，脂質過氧化物15-過氧化二十碳四烯酸(15-HPETE)和13-過氧化十二碳二烯酸(13-HPODE)亦可誘導A301細胞發生凋亡。
正常細胞內每天能產生約1×1011個ROS分子，這些ROS主要來源于：
(1)細胞進行有氧代謝時呼吸鏈產生的副產物，如O2-、H2O2和OH；
(2)呼吸爆發的產物，如O2-、NO、H2O2和Cl-；
(3)脂肪及其他大分子降解時的副產物，如H2O2；
(4)細胞色素P450系統在發揮解毒作用時產生的ROS。
研究發現，當細胞內ROS生成增加或/和抗ROS能力下降時，均可導致內源性ROS增多。有學者報道，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激TNF受體，可導致細胞內ROS水平迅速升高，誘導細胞凋亡，并且這種細胞凋亡能被硫氧還原蛋白或N-乙酰半胱氨酸(NAC)所抑制，同時細胞對TNF-α的敏感性與SOD水平的降低明顯相關。王愛國等讓大鼠自由攝取含150mg/L NaF的水10周后發現，大鼠體內GSH含量下降、ROS和LPO水平升高，肝細胞凋亡率顯著增高，肝細胞凋亡與氧化應激之間存在明顯的正相關。Murakawa等從鯖魚體內提取并純化一種凋亡誘導蛋白(apoptosis-inducing protein，AIP)，用AIP作用于哺乳類細胞后，發現細胞內H2O2水平顯著升高，并誘導細胞快速凋亡。MG132(一種26S蛋白小體抑制劑)使HepG2細胞H2O2水平顯著性升高和線粒體膜電位下降，導致細胞凋亡，這種HepG2細胞凋亡能被抗氧化劑如NAC、GSH和CAT所阻斷；白細胞介素-1(IL-1)可誘導心肌成纖維細胞iNOS表達，使NO含量升高而導致細胞凋亡。Woo等研究發現，As2O3可致人宮頸癌HeLa細胞凋亡，在細胞凋亡早期ROS(主要是H2O2)濃度升高和線粒體膜電位下降，隨后出現caspase-3的激活和DNA斷裂，同時發現NAC能完全抑制As2O3誘導的細胞凋亡，該細胞與CAT共同孵育也顯著性抑制As2O3誘導的細胞凋亡。上述資料充分表明：內源性活性氧生成增多可導致細胞凋亡。
1．3抗氧化應激作用可阻止細胞凋亡
氧化應激使植物表現出與人一樣的細胞凋亡，而植物體內的各類抗氧化物質(如醌類、維生素C、維生素E、酶及多肽類等)能保護植物免受氧化應激誘導的凋亡。許多學者也證實抗氧化劑(如NAC、GSH和CAT等)具有抗凋亡作用。不少學者認為抗氧化物質是通過清除ROS的方式起到抗凋亡的作用，但Anuradha等研究發現，抗氧化物NAC和GSH能阻止NaF誘導的HL-60細胞凋亡，并認為NAC和GSH抗凋亡作用是通過維護線粒體跨膜壓、阻止線粒體釋放CytC和Bcl-2下調實現的。
Bcl-2是原癌基因bcl-2的表達產物，是先被發現的哺乳類細胞凋亡的調控因子，它與死亡基因ced-9編碼的Ced-9分子同源，而Ced-9與線粒體呼吸鏈細胞色素b560復合物Ⅱ相似，說明Ced-9可能具有氧化還原或調節ROS的功能，同時也提示Bcl-2具有調節ROS的作用。細胞內bcl-2表達增強可阻斷ROS相關的細胞凋亡，而且Bcl-2能抑制ROS導致的細胞凋亡，但Bcl-2是以什么方式阻斷ROS誘導的細胞凋亡目前尚無定論。有報道，在GSH耗竭的神經細胞，Bcl-2不僅可中和H2O2和阻止脂質過氧化物的形成，而且可抑制細胞壞死，據此有人認為Bcl-2通過抑制ROS的形成而阻止細胞凋亡；但另有研究顯示，Bcl-2能抑制缺乏ROS的細胞凋亡，綜合多方面資料來看，抑制ROS的形成并非Bcl-2抑制細胞凋亡的途徑。Steinman認為，Bcl-2本身不是一種抗氧化劑，而是作為一種氧化原對細胞產生氧化應激，誘導細胞內源性抗氧化能力的增強，如SOD、GSH-Px、CAT等酶活性升高，從而阻止細胞凋亡；不過也有人認為，Bcl-2主要是通過維護線粒體膜的跨膜壓，阻抑線粒體釋放死亡因子如CytC、凋亡誘導因子(a!ooptosis-inducingfactor，AIF)、Pro-caspase-3，6，7等而起到抗凋亡作用的。
2氧化應激誘導細胞凋亡的分子機制
氧化應激誘導細胞凋亡的分子機制目前還不十分清楚，概括起來主要有以下四種認識。
2．1 ROS活化NF-κB并誘導NF-κB表達
核轉錄因子NF-κB(nuclear factor-KappaB，NF-κB)在正常細胞中與其抑制蛋白(IKB)結合而處于失活狀態，許多刺激因素如干擾素(IFN)、脂多糖(LPS)、IL-1、紫外線、病毒等都可誘導IKB磷酸化而使NF-κB活化。NF-κB的激活通常是由氧化刺激引起的，因為ROS可促進蛋白激酶C(PKC)的激活，活化的PKC磷酸化IKB，導致后者與NF-κB解離而使之活化。kotharius等研究發現，氧化應激可活化對其敏感的核因子NF-κB；Angkeow等認為，細胞外的氧化刺激可激活細胞膜上Raci調控的NAD(P)H氧化酶[racl-regulated NAD(P)H oxidase]，后者促使細胞漿中ROS的水平增高，ROS可直接激活NF-κB，也可以通過氧化還原因子-1(redox factor-1，Ref-1)或其他途徑間接使NF-κB活化，如通過調節IKB激酶的活性及影響NF-κB與IKB的親和力的方式來調節NF-κB的活性。Augkeow等在研究中發現一個有趣的現象，Ref-1在細胞漿中抑制Racl誘導的氧化應激和NF-κB的激活，但是它一旦進入細胞核后，可以提高NF-κB與DNA的結合能力，促進基因轉錄，表現出核內外的雙向作用。NF-κB被激活后，轉位進入細胞核內，與凋亡相關基因如c-myc等的NF-κB調控元件結合，促進基因轉錄，誘導細胞凋亡。高穎等用300μmol/LH2O2作用于K652細胞，發現大量細胞凋亡，LCSM(激光共聚焦掃描顯微鏡)顯示凋亡細胞內NF-κB表達增多，提示NF-κB具有促凋亡作用。
2．2線粒體介導的細胞凋亡
線粒體是重要的細胞器，其DNA(mtDNA)是裸露的，并與呼吸鏈和富含脂質的線粒體膜緊密相連，使其對氧化應激損害的敏感性較核DNA更高；加之催化mtDNA復制的DNA聚合酶不具備校讀功能及mtDNA缺乏修復機制等原因，造成mtDNA的損傷積累效應，從而出現片段的丟失、修飾及插入突變，突變的mtDNA可編碼結構和/或功能改變的蛋白質(其中一些參與電子傳遞)，又進一步促進氧自由基的生成，造成惡性循環。Zmmami等的實驗結果表明ROS的增加可直接或間接損傷線粒體膜，造成膜電位下降，一些學者的研究結果支持這一結論。而線粒體膜電位的下降可導致膜的通透性增高，使線粒體膜間腔的CytC釋放入胞漿，與凋亡激活因子-1(apopotosisactivating factorl，Apaf-1)及pro-caspase-9形成凋亡小體(apoptosome)，在ATP參與下，凋亡小體內的pro-caspase-9可自身激活，形成具有活性的caspase-9，后者進一步激活caspase-3、6、7等；活化的caspase可進一步導致線粒體膜破裂，致使線粒體進一步釋放其他一些caspases及激活因子(如AIF、熱休克蛋白60/100(Hsp60/100)等)；caspase-3、6、7被激活后，可催化靶底物分裂，如分裂DNA片段化因子45(DNA Fragmentation factor 45，DFF45)釋放出具有活性的DFF40，后者進入核內使DNA有序片段化；分裂聚ADP核糖聚合[poly-(ADP-Ribose)polymerase，PARP]和復制因子C大亞基(largesubmfit of replication factor C，RFC140)引起DNA修復和復制障礙，導致細胞凋亡。
2．3 ROS損傷DNA，激活P53誘導細胞凋亡
不少學者認為ROS可直接損傷DNA，因為ROS的中間產物自由基可直接作用于核酸，引起堿基的修飾和DNA鏈斷裂，導致聚ADP核酸轉移酶的活化和P53的積累，從而導致細胞凋亡，Schmitt等的研究結果支持這一結論。DNA斷裂損傷可以激活DNA依賴性的蛋白激酶(DNA-PK)和ATM(ataxia telangiectasia mutated，突變后患運動失調性毛細血管擴張癥的基因表達的蛋白分子，是一種絲、蘇氨酸蛋白激酶)，二種酶皆催化c-Abl(一種酪氨酸蛋白激酶)S-465磷酸化激活，后者再結合P53加強其穩定性，這與Martin等的研究結果吻合，許多凋亡因子基因啟動子都存在P53反應元件(P53 responsive element，PRE)，結合P53后被激活轉錄表達，如促使Fas、FasL、Apaf-1、DR-5和Bax等表達增高，而對bcl-2基因則抑制其表達；同時，P53還促進內質網釋放TNF-α和Fas，也能與DNA復制蛋白A(replicationprotein A，RPA)結合，阻止DNA復制，上述效應激活caspase-3，6，7，促進細胞凋亡。但P53也促進P21表達而導致G1期阻滯，為什么DNA受損的細胞向凋亡方向而不是向細胞周期阻滯方向發展呢?Seoane等的研究提供了一個合理的解釋，轉錄因子Myc被DNA連接蛋白Miz-1招募到P21啟動子上，阻止P53及其他活化因子對P21的激活，從而選擇性地抑制了P53對P21的轉錄活化作用，抑制P21表達，促進細胞凋亡。也有人認為ROS激活P53，誘導FDXP基因(P53家族一個靶基因)表達FR(ferredoxinreductase)，使細胞對ROS介導的細胞凋亡更敏感。
2．4 ROS激活SAPK通路，介導細胞凋亡
絲裂原活化的蛋白激酶(MAPKs)信號通路包括三個主要的蛋白磷酸化級聯，即細胞外信號轉導蛋白激酶(ERKs)、C-Jun N-末端激酶(JNKs)和P38-MAPKs，后兩者可被多種應激原激活，故也稱應激活化的蛋白激酶(SAPKs)。Ma等研究發現，ROS可激活P38通路；不少學者也證實了ROS可激活JNK。在靜止細胞中，JNK與P38定位于細胞漿與細胞核，一旦被激活，細胞漿中JNK與P38轉位到細胞核，磷酸化修飾轉錄因子ATF-2和EIK-1，促進相關基因轉錄、表達，同時JNK與P38還磷酸化激活MAPK激活蛋白激酶2與3(MAPKAPK2，3），進而對低分子量的熱休克蛋白磷酸化，Hsp能易化激活caspase，導致細胞凋亡。Inoshita等研究顯示，氧化應激導致JNK活化，后者磷酸化Mcl-1(Bcl-2家族成員之一)絲氨酸121和酪氨酸，使Mcl-1失活，導致細胞抗凋亡能力下降，而轉染未磷酸化的Mcl-1后，細胞抗凋亡能力得到增強，表明Mcl-1在抗細胞凋亡中起重要作用。
此外，Carmody等用ROS誘導視網膜細胞后，細胞出現了磷脂酰絲氨酸(PS)外露、DNA片段化、細胞皺縮及細胞膜出現囊泡等典型的凋亡特征；同時用TUNEL法也檢測到大量陽性細胞，但在整個細胞凋亡過程中，caspases均沒有被激活，使用caspase抑制劑zVAD-fnnk、DEVD-CHO、BD-fmk也沒能阻止凋亡的發生，表明視網膜細胞的凋亡過程中存在一條不依賴caspase的途徑。Isliisaka等在研究H2O2致HL-60細胞凋亡的過程中也發現，當H2O2濃度在50μmol/L以上時，溶酶體在細胞凋亡過程中發揮一定的作用，認為存在一條溶酶體介導的細胞凋亡途徑。氧化應激引起細胞凋亡是當今醫學領域的一個研究熱點，其分子機制研究才剛剛起步，尚有許多問題需要進一步探討。