聞劍飛劉玉倩王海濤趙斌袁克星
《河北師范大學學報(自然科學版)》2009年02期
【作者單位】：河北師范大學體育學院
收稿日期：2008-10-15
基金項目：國家自然科學基金(30700390)；河北師范大學博士基金(L2005828)
【摘要】：
線粒體呼吸鏈是運動內源性活性氧(ROS)產生的主要來源，內源性ROS產生增多，可導致脂質、蛋白質及核酸等物質的氧化損傷。研究表明，ROS產生可引起質子漏，質子漏增加可降低ROS生成，提示ROS與質子漏之間存在一種反饋回路；解偶聯蛋白(UCPs)參與了這種反饋調節，但其確切分子機制尚不清楚。從運動中線粒體ROS產生及其機制等方面進行了綜述。
機體在有氧代謝過程中會產生一類具有較活潑化學性質的含氧自由基及其衍生物———活性氧(reactive oxygen species，ROS)，這類物質包括超氧陰離子(O2·-)、單線態氧(1-O2)、羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)、脂質過氧自由基(LOO·)等。在正常情況下，機體內ROS產生和清除處于動態平衡。研究表明，急性劇烈運動時，機體內清除ROS的能力不足以平衡運動應激情況下產生的ROS時，可引起運動性內源ROS產生增多，導致脂質、蛋白質及核酸等物質的氧化損傷。線粒體是運動中能量供應的“動力工廠”，也是運動中內源性ROS產生的主要部位。本文中，筆者從線粒體ROS產生部位及調節機制等方面進行了綜述。
1運動中活性氧產生的實驗研究
1．1運動中活性氧產生的直接證據
1982年，Davies等初次應用電子自旋共振技術(electron spin resonance，ESR)直接證實了力竭運動后肝臟、肌肉中自由基明顯增多的現象，從而找到了運動誘發ROS生成增多直接的證據。隨后，陳英杰等也應用ESR技術觀察到運動后骨骼肌中自由基信號增加。隨著研究方法和儀器的更新，近年來的研究也為運動中ROS產生的機理提供了直接證據。cArdle等通過培養H-2kb肌細胞(一種骨骼肌成肌細胞，來源于tsA58型鼠)，用還原型二氯熒光素(DCFH)探針直接測定H-2kb細胞在電刺激前、中、后ROS的產生，研究表明，在安靜時DCFH的氧化速率未發生變化，而在持續10min的電刺激后，DCFH的氧化速率增加了4倍，且刺激結束后仍然保持較高的速率；研究還表明，當給予過氧化物清除劑1，2-二羥基苯-3，5-二磺酸鈉(Tiron)時，可減少DCFH氧化生成的H2O2。Bejma等以青年和老年鼠在一次力竭運動后骨骼肌ROS的產生的研究也表明，劇烈運動使青年鼠DCFH氧化速率增加了38％，老年鼠增加了50％。張勇等采用遞增負荷跑臺運動研究表明，急性運動中骨骼肌線粒體中ROS生成呈先上升后下降的變化趨勢，其中運動至45、90、120min時均較安靜時顯著升高，于120min達到峰值，隨后150min時顯著降低。潘紅英等以電刺激C2C12細胞使其產生收縮運動為模型，DCFH-DA熒光探針檢測細胞內ROS產生的時相變化，研究表明，在刺激60min時ROS的生成速率顯著升高，然后緩慢下降，繼續刺激到120min時，ROS生成再次升高，隨后迅速下降。上述研究采用不同的方法手段直接測定了細胞內ROS產生，為進一步研究運動中ROS產生在生理學和病理學中的生物意義提供了實驗依據；但采用ESR技術需要熟練的實驗技術和昂貴的儀器，而細胞內植熒光探針在實驗過程中易受外界因素的影響，因此，需要進一步探索研究一種準確、簡便、經濟的方法測定內源性ROS的產生，為后續的科學研究提供方法學基礎。
1．2運動中活性氧產生的間接證據
大量研究表明，在進行一次急性有氧運動時，隨著耗氧量的激增，內源性ROS大量生成，導致機體氧應激加強，引起脂質、蛋白質及DNA等氧化損傷和機體抗氧化能力下降等，由于ROS的壽命短難以檢測，因此，在研究中常用這些氧化底物的終產物或副產品來間接反映ROS產生及其對機體造成的危害程度，包括丙二醛(MDA)，蛋白質羰基含量(protein carbonyl，PC)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)，總抗氧化能力(T-AOC)等指標，1978年，Dillard等初次報道人以50％至大攝氧量負荷踏車運動1 h后，呼出氣中脂質過氧化產物戊烷含量明顯增加。隨后，國內外學者進行了大量研究，Bejma等研究表明，劇烈運動后骨骼肌脂質過氧化產物MDA增加了20％，氧化型谷胱苷肽(GSSG)的含量增加、GSH/GSSG比值降低。張蘊琨等研究表明，在力竭游泳運動后，小鼠骨骼肌、肝臟中MDA含量顯著上升，血清CK、LDH活性顯著升高，SOD呈下降趨勢。徐冬青等觀察力竭運動后大鼠骨骼肌形態學改變與自由基損傷的關系，結果顯示，運動后即刻骨骼肌MDA水平更高，運動后24h骨骼肌MDA仍維持較高水平，48h后骨骼肌MDA呈明顯下降趨勢，但仍高于對照組。Bachur等以三級運動負荷不同持續時間為運動模型觀察大鼠骨骼肌中MDA、GSH、VE的變化，結果表明，與安靜對照組相比，隨著運動負荷的增加和持續時間的延長，大鼠骨骼肌MDA水平逐漸增加，GSH、VE濃度在不同負荷下降低程度不同，在小負荷運動中以GSH降低為主，隨負荷增加VE濃度逐漸降低。另外，大量研究表明，補充抗氧化劑可提高機體清除ROS的能力，降低氧化應激引起的損傷。You等報道大鼠補充VC+VE 2周后，下坡跑，運動后2h比目魚肌、股中肌及血漿中PC濃度顯著低于對照組。Li等以過度運動損傷模型觀察補充Cu/Zn-SOD對骨骼肌氧化損傷影響的研究表明，補充Cu/Zn-SOD組在第3、7d血漿SOD、GSH-Px總抗氧化能力(T-AOC)與對照組相比顯著升高，MDA、CK的含量顯著降低。
另有研究表明，由運動引起的氧化應激產物無顯著性變化。Hoffman等研究不同強度下骨骼肌的過氧化反應，以11名男子運動員為研究對象，在60％和90％至大負荷的運動強度下進行4組蹲舉練習，結果顯示在2種強度的運動中血漿MDA濃度無顯著性變化，研究認為MDA濃度的變化獨立于運動強度。造成這種差異的原因可能與研究對象、運動方式等不同有關。總之，急性運動引起的ROS大量生成，機體抗氧化能力下降，導致組織氧化應激加強，其代謝終產物或副產物增多，已被大量實驗所證實。
2運動中活性氧產生的機制研究
2．1線粒體呼吸鏈是活性氧產生的重要來源
在機體物質和能量代謝過程中，能源物質經各自代謝途徑進入線粒體，經三羧酸循環逐步脫氫，終在線粒體呼吸鏈通過各種酶和輔酶的催化下與氧分子結合生成水，同時在此過程中偶聯著能量的生成與利用、轉移。Indo等以魚藤酮、3-硝基丙酸、抗霉素A、氰化鈉等物質抑制線粒體呼吸鏈研究表明，當呼吸鏈抑制時ROS大量生成。Schonfeld等研究表明，在順呼吸鏈條件下，ROS產生增加與呼吸鏈電子傳遞抑制呈線性關系，復合物Ⅰ、Ⅲ等部位是線粒體內源性產生的主要部位。St-Pierre等通過加入不同底物和抑制劑來測定大鼠骨骼肌、心肌、肝臟線粒體中ROS的產生，研究顯示，加入棕櫚酸肉堿時骨骼肌、心肌線粒體中有過氧化物大量生成；當用魚藤酮(一種呼吸鏈抑制劑)抑制復合物Ⅰ時，發現過氧化物大量生成，提示復合物Ⅰ是ROS產生的部位之一。另有研究認為，CoQ是線粒體呼吸鏈重要組成部分，也是ROS產生的主要部位之一，電子經CoQ傳遞時會引起半醌(QH·)的產生，QH·可與氧分子作用生成O2·-。進行運動時線粒體QH·轉運速率大大加快，這就為生成較多的活性氧創造了條件。Quinzii等研究表明，在原發性CoQ10缺乏造成呼吸鏈功能障礙中，ATP合酶受到抑制，ROS產生增加，引起脂質和蛋白質氧化損傷。
2．2活性氧產生機制——電子漏與質子漏
在線粒體呼吸過程中，電子傳遞中途“漏出”少量電子直接單價還原氧分子形成O2·-，即線粒體電子漏(electron leak)，研究表明，線粒體呼吸鏈電子漏是運動性內源ROS產生的重要來源。在運動時，由于機體代謝增加，耗氧量激增，進入呼吸鏈的氧還原量增加，電子漏出呼吸鏈概率增加，引起O2·-生成速率增加。文獻研究表明，運動后骨骼肌線粒體O2·-生成顯著增高，脂質過氧化顯著增加，說明電子傳遞過程中電子漏形成的O2·-是運動性內源ROS的重要來源。若電子傳遞鏈過程中泵出的質子通過其他途徑返回線粒體基質，形成“質子漏(protein leak)”，會破壞內膜兩側的電化學梯度，使ATP生成受到抑制。目前，質子漏現象發生的分子機制尚不清楚。劉樹森等提出線粒體態4呼吸中的電子漏產生的O2·-可能作為內源性質子載體，即“電子漏引起質子漏學說”。時慶德等在運動性疲勞的線粒體膜分子機制的研究顯示，O2·-生成增加、態4呼吸速率明顯加快、磷氧比顯著下降，表明力竭性運動后大鼠骨骼肌線粒體電子漏導致線粒體質子漏增多，是運動性疲勞狀態下線粒體氧化磷酸化偶聯程度下降的重要因素，實驗結果支持電子漏引起質子漏假說。研究認為，活性氧產生與質子漏之間存在一個反饋回路。線粒體在電子傳遞過程中“漏出”的少量電子直接單價還原氧分子形成O2·-，誘導質子漏，導致氧化磷酸化解偶聯，抑制ATP的生成。但此過程可使線粒體內膜跨膜電位不再升高，而維持在適宜的水平，因此電子漏途徑產生的ROS也是保護細胞的調節機制之一。
2．3活性氧產生的反饋調節——解偶聯蛋白
解偶聯蛋白(UCPs)是存在于線粒體內膜上的一種轉運蛋白，與線粒體能量代謝、活性氧生成及脂肪代謝有關。近年來研究表明，UCPs家族中UCP3主要分布在骨骼肌線粒體中，與運動密切相關，Zhou等研究發現，急性跑臺運動30min即刻大鼠骨骼肌UCP3mRNA表達迅速增加，運動20min后達到安靜時的7倍，而UCP3蛋白在運動30min即刻也顯著升高。氧化磷酸化的“溫和解偶聯”(mild uncouplig)是調節ROS產生潛在機制，這種調節機制與解偶聯蛋白(UCPs)有關。Echtay等研究表明，在線粒體呼吸鏈ROS產生過量時，可激活線粒體內膜上的UCPs，作為一個反饋的應答并通過UCPs輕度的解偶聯作用降低ROS生成，保護線粒體不受氧化損傷。
近年來研究表明，UCPs可誘導線粒體內膜質子導性增強，研究認為，由電子傳遞鏈產生的O2·-能夠激活UCPs的質子導性，引起線粒體溫和解偶聯，ROS可能通過激活UCP3表達與質子漏之間存在一個準確的反饋調節回路。張勇等研究表明，在ROS遞增的同時，運動中UCP3mRNA和蛋白表達水平也呈相似趨勢，認為UCP3表達增加可加大線粒體呼吸鏈質子漏，促進呼吸鏈電子傳遞，減少線粒體ROS生成及其可能引發的氧化損傷。張桂忠等認為，隨著ROS大量生成，其可能通過“ROS-質子漏”和“ROS-UCP3-質子漏”2條途徑在運動中線粒體能量轉換的準確調控中起“分子開關”作用，并作為始動因素參與了呼吸鏈電子傳遞與能量轉換的能量分配的反饋調節，調控ATP生成。馬國棟等認為，骨骼肌線粒體中UCP3水平的升高，可能增加線粒體內膜質子導性，降低線粒體內膜電位，從而抑制線粒體ROS的過量生成。另有研究發現，UCP3基因敲除鼠，線粒體ROS生成增加，膜電位升高，表明UCP3蛋白能夠使膜電位保持在ROS大量產生的閾值之下，避免大量ROS的產生。體外研究表明，骨骼肌細胞中UCP3表達增加，同時脂肪酸氧化(fatty acid oxidalion，FAO)增加和ROS生成減少，提示UCP3與FAO和減少ROS生成有關。研究表明，ROS和脂質過氧化的副產品可激活UCP3引起質子漏，認為是減少ROS生成的一種負反饋調節。Bevilacqua等對雄性FBNF1型鼠進行長期能量限制(calorie restriction，CR)的研究表明，經12個月和18個月后，線粒體中H2O2生成和氧化損傷降低，肌肉中UCP3含量增加；線粒體呼吸鏈質子漏減少但無顯著性變化。線粒體ROS的生成可能通過激活UCPs表達引起質子漏，進而抑制ROS生成，但其調控機制尚需深入研究。
3小結
近年來，關于線粒體ROS的研究取得了較大進展，尤其在ROS、電子漏與UCPs之間信號調節機制的研究，為線粒體ROS領域的研究開闊了新的視野，推動了運動引起的氧化應激及機體抗氧化能力等方面的研究。在線粒體ROS產生及調節的分子機制和確切的生理學意義等方面仍需進一步研究。