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高榮敏馬慧萍范小飛賈正平
《醫(yī)學(xué)綜述》2013年07期
【作者單位】：蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科全軍高原環(huán)境損傷防治防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；
蘭州大學(xué)藥學(xué)院；
【摘要】：
細(xì)胞自噬是細(xì)胞依賴溶酶體的分解代謝過程，能降解受損蛋白、衰老或損傷的細(xì)胞器等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可被多種應(yīng)激所觸發(fā)。在營養(yǎng)匱乏或組織缺血缺氧等應(yīng)激條件下，自噬作為相應(yīng)的代謝過程通過提供代用能源及清除功能異常的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)類維持細(xì)胞存活。缺血缺氧是細(xì)胞自噬激活的重要誘因之一，自噬的適度增強(qiáng)可促進(jìn)細(xì)胞在缺血缺氧等狀態(tài)下的存活。該文就細(xì)胞自噬的分子機(jī)制、缺血缺氧狀態(tài)下自噬調(diào)控通路的調(diào)節(jié)機(jī)制及其分子水平檢測技術(shù)的研究進(jìn)展予以綜述。
細(xì)胞自噬是細(xì)胞依賴溶酶體的分解代謝過程，據(jù)底物進(jìn)入溶酶體的方式不同，自噬分為巨自噬、微自噬及分子伴侶介導(dǎo)的自噬三種。巨自噬，即由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的膜包繞待降解物形成自噬體，然后與溶酶體融合并降解其內(nèi)容物。微自噬指溶酶體或者液泡內(nèi)膜直接內(nèi)陷將底物包裹并降解的過程。分子伴侶介導(dǎo)的自噬是指胞質(zhì)內(nèi)蛋白先結(jié)合到分子伴侶后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中，然后被溶酶體酶消化的過程，并且由組成型表達(dá)的熱休克蛋白70作為分子伴侶參與細(xì)胞自噬，且需要關(guān)鍵性因子溶酶體締合性膜蛋白2A(lysosomal-associated membrane protein type 2A，LAMP-2A)。
自噬在臨床上的應(yīng)用愈來愈廣，長期以來自噬被認(rèn)為有助于缺血缺氧狀態(tài)下細(xì)胞的存活。通過自噬標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，哺乳動物細(xì)胞缺氧或再灌注缺血時(shí)細(xì)胞自噬水平增加。近期研究發(fā)現(xiàn)，自噬可以維持基礎(chǔ)狀態(tài)下心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，并在心肌缺血時(shí)保護(hù)心臟。
1細(xì)胞自噬分子機(jī)制
正常生理狀態(tài)下，自噬維持基礎(chǔ)水平，但是當(dāng)出現(xiàn)營養(yǎng)匱乏，氧化應(yīng)激等狀況時(shí)，自噬水平會升高。目前將與細(xì)胞自噬相關(guān)的特異性基因統(tǒng)一命名為autophagy-related gene(Atg)。自噬過程從形態(tài)學(xué)上劃分為三個(gè)階段：自噬誘導(dǎo)階段、自噬體的形成階段、自噬體的成熟及其內(nèi)容物的降解階段。
1．1自噬誘導(dǎo)階段
自噬誘導(dǎo)階段關(guān)鍵性因子是Atg1(酵母中)或其同源物Ulk1(哺乳動物中)復(fù)合物、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)hVPS34-Atg6（Beclin 1)復(fù)合物和Atg14(complexⅠ)及其他相關(guān)元件。Atg1/Ulk 1復(fù)合物受到雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的調(diào)控。mTOR有mTORC1和mTORC2兩種不同的復(fù)合體，其中mTORC1在調(diào)控自噬方面起主要作用。在哺乳動物體內(nèi)，當(dāng)能量充足時(shí)，mTORC1被激活，結(jié)合Ulk1-Atg13-FIP200-Atg101復(fù)合體，從而抑制自噬。當(dāng)細(xì)胞接受到饑餓信號時(shí)，mTORC1失活，與Ulk1-Atg13-FIP200-Atg101蛋白復(fù)合體分離，Ulk1被激活，進(jìn)而導(dǎo)致Atg13、FIF200及Atg101的磷酸化，整個(gè)蛋白復(fù)合體構(gòu)象發(fā)生改變，從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。
1．2自噬體的形成階段
自噬過程被誘導(dǎo)后，由mVps34復(fù)合物Atg14-Vps15-mVps34啟動膜泡的成核反應(yīng)，然后Atg21和Atg24結(jié)合到膜上，形成前自噬體，而后膜泡擴(kuò)張將底物包繞，形成自噬體。哺乳動物中，Ulk1復(fù)合物結(jié)合PI3KhVPS34復(fù)合物和其產(chǎn)物三磷酸肌醇及蛋白質(zhì)/脂質(zhì)復(fù)合體PI3-phosphate(PI3P)連同PI3P的效應(yīng)蛋白導(dǎo)致自噬吞噬體的形成。吞噬泡的延伸及自噬吞噬體的閉合需要Atg9和Atg8(哺乳動物中代表了Atg8蛋白家族：LC3A、LC3B、LC3C、GABARAP、GABARAPL1和GABARAPL2/GATE16)，其中Atg9是自噬體形成過程中參與的膜整合蛋白，Atg9的多聚化促進(jìn)了自噬體膜的形成。LC3家族蛋白的C末端與Atg12-Atg5-Atg16L復(fù)合體相結(jié)合，該復(fù)合體參與自噬體的形成(Atg12先由泛素連接酶活化后與Atg5形成復(fù)合體，Atg5-Atg12進(jìn)而與含有coiled-coil結(jié)構(gòu)域蛋白Atg16結(jié)合形成多亞基蛋白復(fù)合體)。Atg8蛋白參與吞噬泡膜的延伸、閉合并形成雙重膜的自噬吞噬體的過程。
1．3自噬體的成熟及其內(nèi)容物的降解階段
自噬體和溶酶體融合后，自噬體內(nèi)包裹的核糖體、蛋白質(zhì)聚集體、線粒體等成分將被溶酶體內(nèi)的多種水解酶降解，某些降解后的產(chǎn)物，如氨基酸、脂肪酸等會重新參與到新陳代謝中去。近期研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞中，分子伴侶介導(dǎo)的自噬中自噬體與溶酶體融合過程需要LAMP-2A這一關(guān)鍵性分子。
2缺血缺氧狀態(tài)下自噬調(diào)控通路的調(diào)節(jié)機(jī)制
細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)與多個(gè)通路多個(gè)因子有關(guān)，目前研究比較透徹的是Bcl-2蛋白家族、mTOR通路、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase，AMPK)通路和p53通路（圖1）。下面將對各個(gè)通路及缺血缺氧狀態(tài)下各通路相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行概述。
2．1 Bcl-2蛋白家族
Bcl-2蛋白家族是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因家族，研究發(fā)現(xiàn)該家族與細(xì)胞自噬有密切關(guān)系，對細(xì)胞自噬具雙重作用。其中，抑制凋亡的Bcl-2、Bcl-x、Bcl-xL及Mcl-1等蛋白促進(jìn)自噬，而促凋亡蛋白。Bax、Bad、Bcl-x等卻可以促進(jìn)自噬的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1為自噬調(diào)控基因，包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域：BH3、螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域及輸出結(jié)構(gòu)域。
Bcl-2通過與Beclin-1的BH3結(jié)合，抑制細(xì)胞自噬，饑餓處理后JNK1被激活，磷酸化Bcl-2，Bcl-2-Beclin-1復(fù)合物解離，游離出Beclin-1，形成Beclin1-hVPS34-PI3K復(fù)合體，從而促進(jìn)自噬。
mVps34、UVRAG及Bif-1等因子則通過與Beclin-1的不同結(jié)構(gòu)域結(jié)合并相互作用上調(diào)自噬水平。研究發(fā)現(xiàn)，mVps34可與Beclin-1的螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促進(jìn)自噬；UVRAG可與Beclin-1的螺旋—螺旋結(jié)構(gòu)域結(jié)合，上調(diào)自噬水平；Bif-1則通過UVRAG-Beclin-1復(fù)合物來激活mVps34，進(jìn)而促進(jìn)自噬。
2．2 mTOR通路
mTOR是一種在進(jìn)化上較為保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇激酶相關(guān)蛋白激酶的家族成員，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、凋亡、自噬等方面具有重要作用。
研究發(fā)現(xiàn)，mTOR存在兩種不同的復(fù)合物形式：對雷帕霉素敏感的mTORC1包括mTOR、raptor（regulatory-associatedprotein of roTOR)、mLST8(mammalianortholog of LST8)、PRAS40(proline-richAkt substrate of 40kDa)，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡、能量代謝和細(xì)胞自噬；對雷帕霉素不敏感的mTORC2包括mTOR、mLST8、rictor（rapamycininsensi tive companion of mTOR)、mSIN1(mitogen-activated protein kinase-associated protein 1)，主要與細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞存活有關(guān)。其中，mTORC1在調(diào)控自噬方面起主要作用。
當(dāng)細(xì)胞缺氧時(shí)，可通過REDD1(regulated indevelopment and DNA damage 1)蛋白激活復(fù)合型結(jié)節(jié)性硬化1/2(tuberous sclerosis complex 1/2，TSC 1/2)復(fù)合物，繼而抑制了RHEB，終抑制mTORC1，激活細(xì)胞自噬。TSC1/TSC2異二聚體能夠接受Akt等上游激酶信號。酪氨酸激酶受體(tyrosine kinasereceptor，RTK)接受上游生長因子的信號后自體磷酸化激活，進(jìn)而激活兩條關(guān)鍵通路：PI3K-I通路與Ras通路。酪氨酸激酶受體激活PI3K-I通路后，促使磷酸肌醇依賴性蛋白激酶激活A(yù)kt，繼而抑制下游蛋白復(fù)合體TSC1/TSC2，激活mTORC1，抑制細(xì)胞自噬。Ras通路激活后，可激活PI3K-Akt-mTORC1通路而抑制自噬，也可通過Raf-1-MEK1/2-ERK1/2通路激活自噬。
當(dāng)營養(yǎng)缺乏或雷帕霉素刺激時(shí)，TORC1活性受抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，這一進(jìn)程需要Atg相關(guān)蛋白。Atg1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是該階段關(guān)鍵的蛋白，它通過與Atg13-Atg17復(fù)合物的相互作用增強(qiáng)自身酶活性，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬；mTORC1可通過raptor與ULK1的作用磷酸化ULK1和mAtg13，抑制ULK1的活性，下調(diào)細(xì)胞自噬。當(dāng)葡萄糖饑餓時(shí)，AMPK激活，mTORC1活性受抑制，后者對ULK1 Ser757位點(diǎn)的磷酸化減弱。AMPK通過增強(qiáng)對ULK1 Ser317位點(diǎn)和Ser777位點(diǎn)的磷酸化，激活ULK1，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。
2．3 AMPK通路
AMPK是能量代謝變化的感受器，在能量代謝過程中起重要的調(diào)節(jié)作用(圖2)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生葡萄糖饑餓時(shí)，ATP/AMP的比例下降，從而激活A(yù)MPK。AMPK能磷酸化激活TSC1/2復(fù)合物。TSC2具有GTP酶活性，磷酸化激活后的TSC2對小GTP酶Rheb(Ras homolog enriched in brain)起抑制作用，而Rheb是激活mTORC1所必需的，所以通過加強(qiáng)對mTORC1的抑制作用，從而上調(diào)細(xì)胞自噬。研究發(fā)現(xiàn)AMPK可以直接磷酸化raptor，進(jìn)而抑制mTORC1的活性。Decuypere等發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)游離Ca2+的濃度升高可以激活Ca2+/CaMKKβ和TAK1通路，從而激活A(yù)MPK，自噬得以誘導(dǎo)發(fā)生。
缺血缺氧狀態(tài)下，細(xì)胞發(fā)生葡萄糖饑餓，AMPK可通過直接磷酸化ULK1 Ser317位點(diǎn)和Ser777位點(diǎn)激活ULK1，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。mTORC1可通過磷酸化ULK1 Ser757位點(diǎn)從而抑制ULK1的活性，激活A(yù)MPK，mTORC1受到抑制，故mTORC1磷酸化ULK1Ser757位點(diǎn)的作用減弱，從而激活自噬。研究證明，細(xì)胞缺乏營養(yǎng)時(shí)，ULK1Sm638位點(diǎn)和Ser758位點(diǎn)先后去磷酸化，進(jìn)而可以解除AMPK與ULK1間的相互作用，從而激活ULK1，激活細(xì)胞自噬。
2．4 p53通路
p53是一種抑癌基因，對自噬的調(diào)控具有雙重作用。在細(xì)胞質(zhì)中，p53能抑制細(xì)胞自噬，但在細(xì)胞核中，p53能上調(diào)自噬水平。研究發(fā)現(xiàn)，死亡相關(guān)蛋白激酶也是細(xì)胞自噬的重要調(diào)節(jié)因子，能激活p53，進(jìn)而激活A(yù)MPK，上調(diào)自噬。另外，Bcl-2家族促凋亡蛋白Bax、Bad等也能被p53反式激活，使Beclin-1-Bcl-2復(fù)合物得以解離，上調(diào)細(xì)胞自噬。
3缺血缺氧狀態(tài)下細(xì)胞自噬分子水平的檢測技術(shù)
缺血缺氧是自噬激活的重要誘因之一。在營養(yǎng)匱乏或組織缺血缺氧等應(yīng)激條件下，自噬作為相適應(yīng)的代謝過程通過提供代用能源及清除功能異常的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)類維持細(xì)胞存活?？梢酝ㄟ^檢測自噬過程所必需的蛋白分子的表達(dá)來檢測缺血缺氧下細(xì)胞白噬的活動水平。
3．1微管相關(guān)蛋白1輕鏈免疫印跡染色
微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1light ehain3，LC3)是酵母Atgs的同源體，是自噬體膜上的標(biāo)志性蛋白質(zhì)。LC3包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種存在形式，自噬水平升高時(shí)，LC3-Ⅰ表達(dá)水平下降，而LC3-Ⅱ表達(dá)增強(qiáng)，所以兩者的表達(dá)比值可作為細(xì)胞自噬水平的重要指標(biāo)，其比值下降提示自噬活性減弱；反之則說明自噬活性增強(qiáng)?？刹捎妹庖哂≯E和免疫沉淀法檢測LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達(dá)，而后通過兩者的表達(dá)比值來檢測自噬水平。
3．2 GFP-LC3基因轉(zhuǎn)染
GFP-LC3融合蛋白標(biāo)志物的表達(dá)一度被廣泛地用于檢測細(xì)胞自噬水平。有學(xué)者研究出了tfLC3(tandem fluorescent-tagged LC3)、GFP-LC3和RFP-LC3在自噬體和自噬前體共表達(dá)，呈黃色，溶酶體和自噬體融合形成自噬溶酶體后，GFP信號消失，而RFP可耐受降解，所以RFP信號仍在(紅色)，因此可作為自噬溶酶體形成的標(biāo)志。
3．3 p62-SQSTM1疫印跡染色
p62-SQSTM1通過與泛素化蛋白復(fù)合物相互作用，進(jìn)而參與形成自噬吞噬體，激活自噬。研究發(fā)現(xiàn)p62在自噬性溶酶體內(nèi)會被降解，故p62-SQSTM1免疫印跡常作為檢測細(xì)胞自噬水平的可靠指標(biāo)，近來研究表明抑制自噬后，p62的表達(dá)增加。
3．4 LAMP-2A免疫染色
分子伴侶介導(dǎo)的自噬需要關(guān)鍵性因子LAMP-2A。研究發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧等應(yīng)激狀態(tài)能顯著上調(diào)LAMP-2A在mRNA及蛋白的表達(dá)水平，因此可以進(jìn)行LAMP-2A的免疫染色和(或)熱休克蛋白70雙染色來檢測細(xì)胞自噬水平。
3．5 Beclin免疫染色
哺乳動物細(xì)胞中，Bcl-2家族對自噬的調(diào)控也發(fā)揮雙重作用。Beclin-1是酵母Atg6的同源體，可調(diào)控自噬體的生成，故其表達(dá)增強(qiáng)可作為自噬水平增強(qiáng)的重要指標(biāo)。
4展望
細(xì)胞自噬作為一種基本的生命現(xiàn)象，與許多人類疾病包括癌癥、肌病及神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)，并且還與病原體清除率及抗原呈遞相關(guān)。缺血缺氧是細(xì)胞自噬激活的重要誘因之一，然而自噬與缺血缺氧后導(dǎo)致的疾病間的關(guān)系研究尚處于起步階段，缺血缺氧后自噬的分子機(jī)制、所涉及的調(diào)控因子及自噬水平的檢測，尚需要進(jìn)一步的研究，從而有助于發(fā)現(xiàn)利用自噬治療缺血缺氧性相關(guān)疾病的新策略。