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周錦琳田野
《北京體育大學(xué)學(xué)報》2005年09期
【作者單位】：北京體育大學(xué)
國家體育總局體育科學(xué)研究所
【摘要】：
研究表明，運(yùn)動引起胞漿Ca2+聚積是骨骼肌疲勞的重要原因。從研究酸性刺激時胞漿Ca2+的變化入手，從細(xì)胞水平分析急性運(yùn)動可能對骨骼肌胞漿鈣穩(wěn)態(tài)的影響，試圖為全面了解運(yùn)動性疲勞的產(chǎn)生機(jī)制提供理論依據(jù)。實驗中以Fluo-3-AM為Ca2+熒光指示劑，通過激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)對用體外組織分離和培養(yǎng)的方法獲得的單個的骨骼肌細(xì)胞胞漿Ca2+的熒光強(qiáng)度及其動態(tài)變化進(jìn)行觀察。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)：骨骼肌細(xì)胞受到酸性刺激時，胞漿Ca2+穩(wěn)態(tài)被破壞。其總體變化趨勢是先略有增加后迅速減少，直至在比正常低的水平上形成新的動態(tài)平衡。鈣波的變化既有振幅的變化，也有頻率的變化。這可能提示:運(yùn)動后，由于內(nèi)環(huán)境酸性代謝產(chǎn)物的堆積，致使胞漿Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞，終引起骨骼肌疲勞。
骨骼肌疲勞一直是教練員和運(yùn)動員非常關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。隨著研究的不斷深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)胞漿鈣水平變化與骨骼肌機(jī)能之間存在著聯(lián)系。大量的研究表明，運(yùn)動引起肌漿網(wǎng)和線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+能力下降，胞漿Ca2+聚積是骨骼肌疲勞的重要原因。但是直至目前，有關(guān)運(yùn)動后骨骼肌細(xì)胞胞漿鈣聚積的直接證據(jù)卻很少。
從細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度來看，胞漿Ca2+是細(xì)胞的第二信使。為了能夠準(zhǔn)確地傳遞各種信息，細(xì)胞的鈣轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(如細(xì)胞膜、肌漿網(wǎng)和線粒體鈣轉(zhuǎn)移系統(tǒng)等)必須時刻轉(zhuǎn)移Ca2+，把胞漿Ca2+維持在較低水平。但是，胞漿Ca2+不是一成不變的，而是處于一種動態(tài)變化中。細(xì)胞外液的各種刺激因素如PH值、溫度等變化，都可造成Ca2+細(xì)胞信號的改變。運(yùn)動中，細(xì)胞外液的PH值會由于乳酸的產(chǎn)生而下降，pH下降又會造成骨骼肌肌漿網(wǎng)和線粒體攝取和釋放鈣能力的變化，從而影響到胞漿Ca2+水平。但是，以前的研究更多地集中某個時刻Ca2+的濃度變化。據(jù)此，本論文以研究酸性刺激時胞漿鈣的變化為切入點(diǎn)，連續(xù)觀察一段時間內(nèi)胞漿Ca2+的變化，力圖系統(tǒng)地分析急性運(yùn)動可能對骨骼肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的影響，為全面了解運(yùn)動性疲勞的產(chǎn)生機(jī)制提供理論依據(jù)。
1研究方法
1．1溶液的配制
1．1．1磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)
0．20 g KH2PO4，0．20 gKCl，2．90g Na2HPO4 12H2O和8．00gNaCl溶解于800mL重蒸水中，之后加水至1 000mL。再用0．1M鹽酸配制pH值為6．9的PBS溶液。
1．1．2 DMEM培養(yǎng)液
DMEM干粉1包(或1瓶)，Hepes．95g，青霉素(100IU/mL)66mg，鏈霉素(100μg/mL)154 mg，NaHCO3 2．2g。將上述藥品溶解于1000mL超純水或三蒸水中，調(diào)pH值至7．0。配好后除菌過濾，分裝于500mL鹽水瓶，400mL/瓶，4℃保存。
1．1．3胎牛血清
將胎牛血清在56℃40min滅活，4℃保存。使用前，將胎牛血清與DMEM培養(yǎng)液在無菌條件下按體積比1：10的比例混合，使胎牛血清的終止工作濃度為10％。
1．1．4 0．25％胰蛋白酶消化液(含0．02％EDTA)
胰蛋白酶(活性為1：250)2．50g，EDTA 0．20g溶解于100mL PBS溶液中，4℃冷凍24h后，濾器過濾，無菌分裝置于低溫冰箱(-20℃)保存。使用時稀釋10倍。
1．1．5 Fluo-3-AM的配制
1mg Fluo-3-AM溶解于0．805mL DMSO中，凍存。使用時取20μL Fluo-3-AM儲存液溶解于1980μLPBS溶液中，濃度10μmol/L。
1．2骨骼肌細(xì)胞的制備
出生后1～3 d的Wister大鼠3～6只(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供)，采用頸椎脫位方法處死動物。消毒后取出兩側(cè)腿部肌肉剪碎，0．25％胰蛋白酶液消化及分散組織塊，離心，沉淀部分加入的含有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，吹打成細(xì)胞懸液。接種后，放入37℃CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞接種后體外培養(yǎng)至第3 d后，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，開始實驗。
1．3測試指標(biāo)
骨骼肌細(xì)胞胞漿Ca2+的熒光強(qiáng)度及其動態(tài)變化。
1．4測試儀器
美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的MRC 1024型激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)。
1．5測試過程
把培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS溶液漂洗3次；接著用Fluo-3-AM工作液37℃孵育30min然后再用PBS溶液漂洗3次。
把細(xì)胞培養(yǎng)皿置于激光共聚焦顯微鏡的載物臺上，488nm波長激光激發(fā)Fluo-3-AM發(fā)生熒光，然后在高倍油鏡下檢測。選擇合適視野后，開始掃描。每個細(xì)胞樣本均先連續(xù)掃描100～200sec測基礎(chǔ)熒光強(qiáng)度，并觀察強(qiáng)度穩(wěn)定后，分別加入不同PH值的PBS溶液50μL，繼續(xù)掃描，動態(tài)觀察細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化。每組觀察6個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿觀測1～2個細(xì)胞。
1．6試劑和藥品
Fluo-3-AM、DMEM、Heres為SIGMA公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為GIBCO-BRL公司生產(chǎn)，EDTA為美國BioRad公司生產(chǎn)，胎牛血清為天津市川頁生化制品有限公司生產(chǎn)，其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑或試劑。
1．7數(shù)據(jù)分析與圖象采集
數(shù)據(jù)用EXCEL軟件分析處理；圖象用Confocal Assistant 4．02和Adobe Photoshop 6．0軟件采集處理。
2實驗結(jié)果
胞漿Ca2+的熒光強(qiáng)度直接反映了骨骼肌細(xì)胞胞漿Ca2+的水平，其變化包括振幅和頻率的變化兩個方面。圖1為正常情況下胞漿Ca2+熒光強(qiáng)度的變化。從圖3可以看出，大約在30～230sec這段時間內(nèi)，即細(xì)胞處于正常安靜狀態(tài)時，胞漿Ca2+熒光強(qiáng)度在一定的基線上波動，形成了近似于正弦波形的鈣波，振幅約為50μmol/L，頻率約為0．02 HZ(100 sec振動約2次)。
當(dāng)加入pH=6．9的PBS后(圖2、圖3)，胞漿Ca2+的熒光強(qiáng)度總體變化的趨勢是先略有增強(qiáng)后迅速減弱，直至在比正常低的水平上形成新的動態(tài)平衡。鈣波振幅的變化是先快速增大(由正常時的水平增加至60μmol/L)后迅速減小(20～30μmol/L)；頻率則是先減小(0．015HZ，400sec振動約6次)再增大(0．03HZ，100SeC振動3次)。
3分析與討論
根據(jù)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的理論，Ca2+是一種細(xì)胞內(nèi)通訊的化學(xué)信號。胞漿Ca2+作為第二信使，在維持機(jī)體的正常生理功能方面起著非常重要的作用，幾乎一切生命現(xiàn)象都與Ca2+有關(guān)。細(xì)胞鈣信號的產(chǎn)生與終止是胞漿內(nèi)Ca2+增減和波動的結(jié)果。當(dāng)某種外界刺激達(dá)到細(xì)胞表面時，處于細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(或肌漿網(wǎng))及線粒體膜上的鈣通道開放，鈣泵的運(yùn)載作用加強(qiáng)，使得胞外或胞內(nèi)鈣庫中Ca2+釋放至胞漿中，胞漿中的Ca2+濃度增高，這就產(chǎn)生了鈣信號。
細(xì)胞在正常情況下即處于安靜狀態(tài)時，胞漿Ca2+水平一生所謂的鈣波。在本實驗中，胞漿Ca2+的熒光強(qiáng)度反映了骨骼肌細(xì)胞胞漿內(nèi)Ca2+水平。從圖3可以看出，大約在30～230sec這段時間內(nèi)，即骨骼肌細(xì)胞處于正常安靜狀態(tài)時，胞漿Ca2+形成了近似于正弦波形的波動，振動的周期約為50sec，振幅約為50μmol/L。以上結(jié)果說明骨骼肌細(xì)胞胞漿Ca2+在安靜時的變化符合細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)理論的觀點(diǎn)，即正常狀態(tài)下的骨骼肌細(xì)胞胞漿Ca2+以鈣波的形式，周期性振蕩，始終處于動態(tài)平衡中。
運(yùn)動時，肌肉是生成乳酸尤其多的部位。有報道在進(jìn)行短時間至大強(qiáng)度靜力性運(yùn)動和次至大強(qiáng)度動力性運(yùn)動時，肌乳酸由安靜時每千克干肌重4mmol增加到94～114mmol，肌細(xì)胞內(nèi)pH值由安靜時7．0的降到6．5～6．9。Byrd等在實驗中測得Ca2+-ATP酶活性下降，pH也明顯下降，肌肉中乳酸濃度增加了3～4倍。為此，本實驗中選用pH值為6．9的PBS緩沖液作為酸性刺激。
當(dāng)骨骼肌細(xì)胞受到酸性(pH=6．9)刺激時，胞漿Ca2+水平出現(xiàn)了很明顯的變化(如圖2，圖3)，總體趨勢是先略有增加后減少，直至在比正常低的水平上形成新的動態(tài)平衡。造成這種現(xiàn)象的原因可能與細(xì)胞內(nèi)H+的變化有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞外液H+濃度增加時，H+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞膜上的鈣泵具有Ca2+/H+交換能力，可以運(yùn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi)2個H+，向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)出1個Ca2+。細(xì)胞膜上的Na+/H+交換體也可以向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)H+。H+進(jìn)入胞漿，Na+被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外。細(xì)胞膜上的Na+/Ca2+交換體繼而可以作用，把Na+再轉(zhuǎn)運(yùn)回細(xì)胞，同時再把Ca2+排出細(xì)胞外。上述作用的結(jié)果使得胞漿內(nèi)H+濃度增加，而胞內(nèi)Ca2+水平下降。為了不使胞漿Ca2+水平下降，繼續(xù)維持胞漿Ca2+穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞內(nèi)的鈣庫就會起作用。它們可能釋放出大量的Ca2+進(jìn)入胞漿，因而造成胞漿Ca2+增多。但是當(dāng)胞內(nèi)Ca2+增多超過正常水平時，Ca2+釋放會通過負(fù)反饋作用而停止。細(xì)胞膜上的鈣泵和Na+/Ca2+交換體，肌漿網(wǎng)膜和線粒體膜上的鈣泵或Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)體就會把細(xì)胞內(nèi)多余的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)出胞漿，引起胞內(nèi)Ca2+水平下降，在比正常低的水平上重新形成新的Ca2+穩(wěn)態(tài)。
已有的大量研究通過運(yùn)動后骨骼肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)移系統(tǒng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降都推測運(yùn)動至疲勞時骨骼肌細(xì)胞胞漿Ca2+聚積。得出此結(jié)論的依據(jù)主要有二個方面：一是運(yùn)動引起肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)移系統(tǒng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降。Pierce等發(fā)現(xiàn)鼠進(jìn)行1次力竭性游泳后，肌漿網(wǎng)鈣攝取能力下降，而鈣結(jié)合能力未受影響；3次力竭后，肌漿網(wǎng)鈣攝取和鈣結(jié)合能力都顯著性下降。李潔發(fā)現(xiàn)大鼠長時間持續(xù)性跑臺運(yùn)動后，紅肌和白肌肌漿網(wǎng)的Ca2+-ATP酶活性都下降；紅肌Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)初始速率和至大Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力也有變化。二是運(yùn)動引起線粒體鈣轉(zhuǎn)移系統(tǒng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降，線粒體鈣聚積。Duan等讓鼠進(jìn)行下坡跑，結(jié)果運(yùn)動后即刻肌肉內(nèi)線粒體Ca2+濃度與對照組相比均有顯著性增加；48 h后，這種變化更加明顯；同時還發(fā)現(xiàn)未受損傷肌纖維數(shù)與線粒體Ca2+濃度值呈負(fù)相關(guān)。田野等發(fā)現(xiàn)大鼠90mins間歇性下坡跑運(yùn)動后即刻和運(yùn)動后24h與運(yùn)動前相比，線粒體鈣含量分別顯著地增加；運(yùn)動后48h，線粒體鈣含量開始恢復(fù)，但仍高于運(yùn)動前水平。大鼠持續(xù)200mins下坡跑后24 h線粒體鈣含量非常顯著地上升，比對照組增加了81．77％。周錦琳等研究發(fā)現(xiàn)大強(qiáng)度運(yùn)動后即刻大鼠骨骼肌線粒體Ca2+-ATP酶活性略有變化，但無顯著性差異；但在中等強(qiáng)度長時間運(yùn)動后卻非常顯著地下降。把上述實驗結(jié)果概括起來就是，運(yùn)動能力下降時，細(xì)胞內(nèi)鈣庫——線粒體和肌漿網(wǎng)的鈣泵轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+的能力下降，線粒體鈣聚積，終導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞的機(jī)能紊亂。
本研究中當(dāng)骨骼肌細(xì)胞受到酸性刺激時，骨骼肌細(xì)胞胞漿Ca2+穩(wěn)態(tài)受到了破壞。胞漿Ca2+經(jīng)歷了一個先升高再降低，然后在比正常低的水平上重新建立穩(wěn)態(tài)的過程，研究中并未發(fā)現(xiàn)骨骼肌細(xì)胞在受到酸性刺激后有明顯的胞漿鈣聚積現(xiàn)象，這與上述研究的推測結(jié)果不一致。這可能與二個因素有關(guān)：一是與運(yùn)動強(qiáng)度、運(yùn)動階段受到的刺激不同有關(guān)。上面提到的研究大多數(shù)采用大強(qiáng)度或中等強(qiáng)度長時間運(yùn)動或力竭性運(yùn)動，測量的大多是運(yùn)動結(jié)束時或運(yùn)動后恢復(fù)期Ca2+-ATP酶活性或線粒體鈣含量，由此在推測胞漿Ca2+的變化。運(yùn)動強(qiáng)度較大，運(yùn)動時間也較長，因而骨骼肌細(xì)胞中堆積的H+濃度也較高，這可能造成胞漿鈣的不可恢復(fù)性升高。二是與刺激的方式有關(guān)。本研究中采用的是體外模擬刺激的形式，在細(xì)胞外施加酸性刺激使細(xì)胞內(nèi)酸濃度增加，這與運(yùn)動中細(xì)胞內(nèi)酸濃度增加后造成細(xì)胞外液的酸濃度增加不同。另外，本實驗刺激的程度較低(pH=6．9)，刺激的時間也比較短。細(xì)胞雖受到了酸刺激，但仍可以依靠自身調(diào)節(jié)維持胞漿Ca2+的穩(wěn)態(tài)。本研究中雖未發(fā)現(xiàn)骨骼肌細(xì)胞胞漿有明顯的Ca2+聚積現(xiàn)象，但可以肯定的是當(dāng)細(xì)胞外液pH值下降時，骨骼肌細(xì)胞胞漿Ca2+穩(wěn)態(tài)受到了破壞。上述結(jié)果可能提示：在不同強(qiáng)度急性運(yùn)動時，或在運(yùn)動的不同階段，骨骼肌細(xì)胞內(nèi)胞漿Ca2+變化可能不同。在運(yùn)動的初期，肌細(xì)胞pH值下降，但由于刺激時間短，酸性作用不強(qiáng)，骨骼肌細(xì)胞的胞漿Ca2+水平雖然上升，但仍能通過細(xì)胞內(nèi)線粒體和肌漿網(wǎng)等鈣轉(zhuǎn)移系統(tǒng)重新調(diào)節(jié)胞漿Ca2+穩(wěn)態(tài)。隨著內(nèi)環(huán)境酸性程度的不斷加重，鈣轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的機(jī)能可能會減弱，以至于造成胞漿鈣聚積。
骨骼肌細(xì)胞內(nèi)H+濃度升高，胞漿Ca2+水平下降，這也是對正常胞漿Ca2+穩(wěn)態(tài)的一種破壞，它也會給運(yùn)動能力帶來影響，直接的影響就是降低肌肉的張力。如果要達(dá)到某一張力，就需要比正常時更多的Ca2+，這無疑又會影響到肌漿網(wǎng)的功能。若此影響長期存在，那終究還是要降低骨骼肌的機(jī)能。
本研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)骨骼肌細(xì)胞受到酸性刺激時，鈣波不僅只有振幅的變化，還有頻率的變化，振動頻率先減小再增大。這可能也是鈣穩(wěn)態(tài)的改變的一種方式。有研究報道，鈣波頻率的變化不應(yīng)是偶然的因素，它可能也有意義。在H+持續(xù)刺激的情況下，Ca2+信號如果振蕩過大會造成骨骼肌細(xì)胞的損害，頻率變化的方式減少了這種危險。如果胞漿Ca2+持續(xù)保持在較高水平，這就會造成骨骼肌細(xì)胞的的脫敏效應(yīng)，以使得其它需要Ca2+表達(dá)的信息無法表達(dá)。鈣波頻率的改變也許還有減少脫敏作用的意義。若果真如此，那么在加入酸后，鈣波之后下降到低水平上更快速的振蕩的意義就十分明顯。一是可以避免胞漿Ca2+聚積對細(xì)胞造成的損害；二是可以保持細(xì)胞通過鈣信號表達(dá)的信息的正常傳遞。
按照細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)理論的觀點(diǎn)，胞漿Ca2+穩(wěn)態(tài)是細(xì)胞許多信息正常傳遞的基礎(chǔ)，細(xì)胞的鈣轉(zhuǎn)移系統(tǒng)會盡可能地保持胞漿Ca2+的穩(wěn)定，從而維持細(xì)胞的正常機(jī)能。某一時刻胞漿Ca2+增多或減少都不能全面反映Ca2+對細(xì)胞功能的影響。因而，本研究認(rèn)為，急性運(yùn)動中鈣轉(zhuǎn)移系統(tǒng)機(jī)能下降，從而造成胞漿Ca2+穩(wěn)態(tài)的破壞，骨骼肌細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常可能是導(dǎo)致骨骼肌疲勞的原因。
4小結(jié)與建議
1)骨骼肌細(xì)胞處于正常安靜狀態(tài)時，胞漿Ca2+水平在一定的基線上波動，形成了近似于正弦波形的鈣波。骨骼肌細(xì)胞處于酸性環(huán)境中，胞漿Ca2+水平的總體變化趨勢是先略有增強(qiáng)后迅速減弱，直至在比正常低的水平上形成新的動態(tài)平衡。鈣波的變化既有振幅的變化，也有頻率的變化。這種變化的原因可能與胞漿內(nèi)H+濃度升高有關(guān)。
2)本實驗中未發(fā)現(xiàn)骨骼肌細(xì)胞在酸性環(huán)境中胞漿有明顯Ca2+聚積現(xiàn)象，這可能與體外模擬刺激的形式有關(guān)。結(jié)果提示：在不同強(qiáng)度急性運(yùn)動時，或在運(yùn)動的不同階段，骨骼肌細(xì)胞內(nèi)胞漿Ca2+變化可能不同。在運(yùn)動的初期，酸性作用不強(qiáng)時，細(xì)胞通過線粒體和肌漿網(wǎng)等鈣轉(zhuǎn)移系統(tǒng)可以重新調(diào)節(jié)胞漿Ca2+穩(wěn)態(tài)。隨著機(jī)體內(nèi)環(huán)境酸性程度的不斷加重，細(xì)胞自身的這種調(diào)節(jié)作用可能會下降。胞漿Ca2+穩(wěn)態(tài)的破壞可能是導(dǎo)致急性運(yùn)動時骨骼肌疲勞的原因。
胞漿Ca2+始終處于動態(tài)變化中，如何采用更加科學(xué)合理的方法對胞漿Ca2+進(jìn)行測定，仍是一個迫切需要解決的問題。