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作者：唐戎成敏聶永梅陳槐卿
機構(gòu)地區(qū)：四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心生物醫(yī)學(xué)工程實驗室，成都610041
出處：《生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志》
核心刊IC CAS CSA JST AJ PUBMED CSA-PROQEUSTSCOPUS ZGKJHX CSCD
2004年第3期363-366，共4頁
摘要：
血管內(nèi)皮細胞襯于血管腔的表面，是血流機械應(yīng)力的主要感受者。切應(yīng)力可以直接調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞生物活性物質(zhì)的合成和分泌，其中包括誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞生成IL-8，而且IL-8的生成量與切應(yīng)力作用時間有關(guān)。為闡明內(nèi)皮細胞IL-8的生成除了與切應(yīng)力的作用時間有關(guān)外還與切應(yīng)力的強度有關(guān)，我們用不同強度的流體切應(yīng)力(2．09、4．61、6．19、8．51、10．50、12．59、14．41、17．22、18．32dyne／cm2)處理培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，然后采用雙抗體夾心ABC-ELISA技術(shù)檢測內(nèi)皮細胞IL-8蛋白質(zhì)的生成。
結(jié)果顯示：未用切應(yīng)力處理的內(nèi)皮細胞只有極少量的IL-8蛋白質(zhì)生成；切應(yīng)力處理內(nèi)皮細胞后，低切應(yīng)力(2．09dyne／cm2)時IL-8蛋白質(zhì)生成量明顯增加，約為高切應(yīng)力(18．32dyne／cm2)時IL-8蛋白質(zhì)生成量6(作用5h)7倍(作用6h)。IL-8蛋白質(zhì)生成量與內(nèi)皮細胞所施加的切應(yīng)力強度呈反變關(guān)系；直線回歸方程：5h時為y=760．12-36．06x，相關(guān)系數(shù)7=-0．978；6h時為y=781．87-36．66x，相關(guān)系數(shù)7=-0．980。
式中：
y為切應(yīng)力作用下內(nèi)皮細胞IL-8的生成量；
x為施加于內(nèi)皮細胞的切應(yīng)力強度(dyne／cm2)。
不同的切應(yīng)力作用時間(5h、6h)均表現(xiàn)出相同的IL-8蛋白質(zhì)生成量隨切應(yīng)力強度的變化規(guī)律。
提示流體切應(yīng)力誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞生成IL-8的量，不僅與切應(yīng)力的作用時間有關(guān)，而且IL-8的生成量與切應(yīng)力強度有關(guān)。流體低切應(yīng)力誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞IL-8的生成量急劇增高，可能在急性炎癥和動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。
1前言
血管內(nèi)皮細胞(Endothelial cells，ECs)襯于血管腔的內(nèi)表面，是血流與血管壁相互作用的界面，是血流機械應(yīng)力的主要感受者和信號傳導(dǎo)者。血管內(nèi)皮細胞所受到的機械應(yīng)力一般分為3種：血流的剪切應(yīng)力、血管壁的周向應(yīng)力和血流的法向應(yīng)力。其中血流的剪切應(yīng)力通過血管內(nèi)皮細胞切應(yīng)力感受器傳遞和轉(zhuǎn)導(dǎo)力學(xué)信號，調(diào)節(jié)著內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)和功能。目前已發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞在流體切應(yīng)力作用下可以表達多種趨化性細胞因子，如單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactie protein 1，MCP-1)、生長調(diào)節(jié)癌基因(Growth regulated oncogene，GRO)、白細胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)等，并證實力學(xué)刺激通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞表達IL-8來參與炎癥性疾病和動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后過程。流體切應(yīng)力作用于內(nèi)皮細胞不僅可以誘導(dǎo)生成IL-8，而且IL-8蛋白質(zhì)的生成與切應(yīng)力的作用時間有關(guān)。但內(nèi)皮細胞在切應(yīng)力作用下IL-8蛋白質(zhì)的生成量是否與切應(yīng)力強度有關(guān)，國內(nèi)外尚未見報道。因此，本實驗采用雙抗體夾心ABC-ELISA技術(shù)來研究流體切應(yīng)力的強度對培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)IL-8蛋白質(zhì)生成的影響，以期了解流體切應(yīng)力的強度是否也能影響內(nèi)皮細胞IL-8蛋白質(zhì)的生成以及其強度依賴性的變化規(guī)律。
2材料與方法
2．1人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)與鑒定
根據(jù)Jaffe等的方法，本室加以改進。培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞在相差顯微鏡下呈多角形、單層鋪路石狀排列。透射電鏡下，胞漿內(nèi)有Weibel-Palade小體。免疫組織化學(xué)染色可見Ⅶ因子相關(guān)抗原陽性。
2．2流室系統(tǒng)
由一塊有機玻璃平板和一塊玻璃蓋板組成。兩塊板之間有環(huán)形硅橡膠墊圈，可防滲漏。安裝后的流室的尺寸為：長8．5cm，寬2．5cm，高0．3mm。流入孔和流出孔間距離為7．0cm。經(jīng)理論計算，流室測試區(qū)滿足：
(1)層流；
(2)二維流動；
(3)充分發(fā)展流動。
2．3切應(yīng)力處理內(nèi)皮細胞
將傳至2～4代的內(nèi)皮細胞接種到載玻片(7、5cm×2．5 cm)上，待長滿匯合后轉(zhuǎn)移到流室的測試區(qū)。密封后進行流體剪切實驗，由Model 7518-10型蠕動泵(ColeParmer公司，美國)為實驗中的灌流系統(tǒng)提供穩(wěn)定的定常流(Sready flow)，分別選取2．09、4．61、6．19、8．51、10．50、12．59、14．41、17．22、18．32dyne/cm2的切應(yīng)力處理內(nèi)皮細胞。處理時間分別為5h和6h。以未做任何處理的內(nèi)皮細胞做為對照。實驗時流室內(nèi)保持37±1℃，培養(yǎng)液中的緩沖體系可維持pH值在7．2～7．4之間。整個灌流系統(tǒng)處于同一水平面。實驗結(jié)束后收集培養(yǎng)液，-20℃保存待測。
2．4 IL-8含量的測定
用人IL-8定量EIASA試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測培養(yǎng)液中的IL-8含量：將待測液(100μl)依次加入鼠抗人IL-8單抗包被的96孔微孔板，37℃孵育2 h后洗板；加入辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)多抗(50μl)，37℃孵育1h后洗板；加入100μl底物工作液，置37℃顯色5～10min；加入50μl 2 mol/lH2SO4終止反應(yīng)，在492nm處測吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IL-8蛋白質(zhì)濃度。
3結(jié)果
靜態(tài)培養(yǎng)的HUVECIL-8蛋白質(zhì)有低水平的基礎(chǔ)表達，表達量在5．674±0．851～6．398±0．634pg/ml之間；當(dāng)流體切應(yīng)力作用時間為5h，切應(yīng)力強度分別為2．09、4．61、6．19、8．51、10．50、12．59、14．41、17．22、18．32dyne/cm2時，IL-8蛋白質(zhì)生成量明顯增加，分別為684．045±5．334、495．346±8．532、475．547±3．366、446．043±5．633、297．356±5．323、209．083±8．552、141．851±0．562、98．469±0．662、99．5±0．965pg/ml；當(dāng)流體切應(yīng)力作用時間為6h，相同切應(yīng)力條件下IL-8蛋白質(zhì)生成量進一步增加，分別為694．727±5．122、508．090土8．333、486．043±6．546、455．882±8．963、307．557±6．582、218．336±3．342、149．947±6．563、101．5±0．956、100．26±0．556 pg/ml。切應(yīng)力為2．09dyne/cm2時，IL-8蛋白質(zhì)生成量高，約為切應(yīng)力18．32dyne/cm2時IL-8蛋白質(zhì)生成量的6～7倍，IL-8蛋白質(zhì)的生成量與施加于內(nèi)皮細胞的切應(yīng)力強度呈反變關(guān)系。經(jīng)用SPSS10．0統(tǒng)計軟件對切應(yīng)力強度及其對應(yīng)的IL-8蛋白質(zhì)生成量進行回歸與相關(guān)分析，按α＝0．05水平拒絕無效假設(shè)。切應(yīng)力強度與對應(yīng)的IL-8蛋白質(zhì)生成量之間的直線回歸方程為：
y＝760．12-36．06x，相關(guān)系數(shù)r＝-0．978(5h)
y=781．87-36．66x，相關(guān)系數(shù)r＝-0．980(6h)
式中：y為切應(yīng)力作用下內(nèi)皮細胞IL-8蛋白質(zhì)生成量(pg/ml)；
x為施加于內(nèi)皮細胞的切應(yīng)力強度(dyne/cm2)。
對直線回歸和相關(guān)系數(shù)分別進行假設(shè)檢驗，均為p<0．05，具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1)。
4討論
4．1切應(yīng)力強度影響內(nèi)皮細胞IL-8的生成
內(nèi)皮細胞在其整個生命活動過程中始終受到血管中的血流機械應(yīng)力作用。在長期的力學(xué)環(huán)境中，內(nèi)皮細胞獲得了對力的類型、大小敏感的機制。內(nèi)皮細胞能夠感知所處環(huán)境中力學(xué)因素的變化，并做出形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上的調(diào)整以適應(yīng)力學(xué)環(huán)境的改變。
本實驗室張文勝等發(fā)現(xiàn)流體切應(yīng)力可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞表達IL-8基因，而且IL-8mRNA的表達量與切應(yīng)力的作用強度有關(guān)，呈反變關(guān)系，但IL-8蛋白質(zhì)的表達量與切應(yīng)力的作用強度是否有關(guān)，仍是需要進一步研究的問題。因為眾所周知，蛋白質(zhì)才是生命功能的真的執(zhí)行者。以往的研究發(fā)現(xiàn)在層流切應(yīng)力作用下，切應(yīng)力誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞趨化性細胞因子的合成和分泌具有強度和時間依賴性。如Yu等報道4dyne/cm2的切應(yīng)力作用內(nèi)皮細胞MCP-1蛋白質(zhì)的生成量比10dyne/cm2組明顯增高，邢海燕等報道0．72dyne/cm2的切應(yīng)力作用內(nèi)皮細胞5h MCP-1蛋白質(zhì)的生成量比2．4dyne/cm2組明顯增高，這與我們的結(jié)果是一致的。本研究也發(fā)現(xiàn)低切應(yīng)力時內(nèi)皮細胞IL-8蛋白質(zhì)的生成量較高，而在高切應(yīng)力時IL-8蛋白質(zhì)的生成量較低。IL-8蛋白質(zhì)的生成量與切應(yīng)力強度呈反變關(guān)系，低切應(yīng)力通過什么機制誘導(dǎo)了內(nèi)皮細胞IL-8蛋白質(zhì)的合成和分泌?高切應(yīng)力又通過什么機制抑制了內(nèi)皮細胞IL-8蛋白質(zhì)的合成和分泌?這些都是非常有趣和值得深入探討的問題。
4．2不同強度切應(yīng)力影響內(nèi)皮細胞IL-8生成的臨床意義
臨床上發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊好發(fā)生在動脈的分枝開口處和彎曲動脈的凸面，特別是動脈分叉處的外側(cè)壁。這往往是血流方向紊亂和低切應(yīng)力區(qū)域(≤4dyne/cm2)，大大低于其他直通的血管區(qū)域(≥15dyne/cm2)。當(dāng)切應(yīng)力≥15dyne/cm2時，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞NO的釋放，刺激組織纖溶酶原激活物的表達，并減少其抑制物的表達，阻止內(nèi)皮細胞凋亡；減少內(nèi)皮細胞受損后炎癥前細胞因子的激活；抑制平滑肌細胞的遷移，抑制內(nèi)皮細胞趨化性細胞因子、黏附分子等的表達；誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞抗粥樣硬化基因的表達。因而具有抗動脈粥樣硬化作用。而低切應(yīng)力(≤4dyne/cm2)對內(nèi)皮細胞的調(diào)節(jié)作用正與此相反，促進內(nèi)皮細胞增生、白細胞黏附，因而具有促動脈粥樣硬化作用。另外臨床上急性炎癥往往伴有劇烈的血流動力學(xué)變化。切應(yīng)力對炎癥反應(yīng)有調(diào)節(jié)作用，例如切應(yīng)力使內(nèi)皮細胞細胞間黏附分子-1(Intracellular adhesionmolecule-1，ICAM-1)的表達上調(diào)，增加白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附；生理范圍的切應(yīng)力使中性粒細胞出現(xiàn)聚集，在聚集細胞的接觸部位F-肌動蛋白聚合化，并伴有細胞內(nèi)Ca2+濃度升高。低切應(yīng)力區(qū)域，如我們實驗中所用的2．09dyne/cm2(相當(dāng)于微靜脈水平，2．10dyne/cm2)、4．61dyne/cm2(相當(dāng)于毛細血管后靜脈水平，4．60dyne/cm2)、6．19dyne/cm2(相當(dāng)于小靜脈水平，6．10dyne/cm2)，這正是急性炎癥時中性粒細胞滲出血管并向炎癥中心趨化的部位。在切應(yīng)力的作用下，內(nèi)皮細胞分泌IL-8。IL-8激活中性粒細胞運動裝置，使其定向游走(趨化作用)；促使其表達黏附分子；刺激中性粒細胞脫顆粒和呼吸爆發(fā)，促進溶酶體酶釋放；促使胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高，使胞漿的48KDa蛋白磷酸化，在切應(yīng)力和其它因素的共同作用下，形成了急性炎癥時復(fù)雜的病理生理變化。我們認(rèn)為低切應(yīng)力可能是通過IL-8來介導(dǎo)急性炎癥發(fā)展過程的。另外，在動脈的分枝開口處和彎曲動脈的凸面等低切應(yīng)力區(qū)域，切應(yīng)力誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞表達IL-8，IL-8趨化單核細胞和淋巴細胞到該部位，并同時介導(dǎo)單核細胞在內(nèi)皮細胞上的滾動和牢固黏附，可能是動脈粥樣硬化作用的始動因素之一。而在高切應(yīng)力(17．22、18．32dyne/cm2)時IL-8的生成量明顯降低，則可能具有抗動脈粥樣硬化的作用。