(北京心肺血管醫療研究中心，血液流變學研究室，北京100029)
郭金良李勇孫素琴
(清華大學化學系，北京100084)
摘要：
為探明自由基引起紅細胞流變性改變的作用機理，我們對體外自由基作用三十分鐘前后紅細胞膜剪切彈性模量、細胞表面指數、膜脂質分子和蛋白分子流動性進行了比較分析。發現自由基作用后，紅細胞膜剪切彈性模量、膜脂質分子和蛋白分子的相對旋轉時間分別增加了百分之49.8、百分之49.5和百分之191.4，而紅細胞表面指數無變化；此外，隨著自由基濃度的降低以上變化也隨之減輕；在自由基損傷后的第三小時，上述改變部分回復。本研究說明，自由基引起脂質和蛋白分子流動性降低共同導致紅細胞膜剪切彈性模量的增加，并且一定濃度自由基對紅細胞流變性的損傷是部分可逆的。
關鍵詞：自由基；紅細胞膜剪切彈性模量；膜脂質分子流動性；膜蛋白分子流動性
分類號：R318.01
0前言
除了神經體液調節因素和灌注壓外，影響微循環灌注的主要環節還有毛細血管床的完整及良好的紅細胞流變性。當紅細胞流經內徑小于自身的滋養毛細血管時需要變形才可通過。已有許多關于疾病病程中紅細胞的變形特性被改變的報道。紅細胞的硬度不僅受細胞內外多種因素的影響，同時還取決于細胞膜的化學成分(脂質和蛋白)及它們的流動性。當某些物理化學的、感染或其他的病因引起紅細胞膜成分、結構和代謝功能變化時都將影響膜流動性進而影響整個細胞的變形性并由此干擾微循環灌注。
自由基產生過量或出現在細胞的某些部位可造成病理學改變，特別是以氧為核心的自由基已被證明與缺血/再灌注期間的中樞神經系統和心臟的病理改變有關。缺血/再灌注期間脂質過氧化不僅破壞了細胞膜的完整性，同時還引起游離脂肪酸釋放進而導致了水腫和花生四烯酸代謝等病理學變化。A.M.Phelan報道了在腦缺血/再灌注期間，毛細血管內皮細胞膜脂質區流動性明顯降低，認為與此期間產生的自由基損傷有關。
但到目前尚未見有關自由基對紅細胞膜分子流變性損傷機理的研究報道。為探明自由基對紅細胞流變性的作用機理，本文除觀察了自由基對離體健康人紅細胞變形性的影響外，還探討了自由基對細胞膜脂質和蛋白分子流動性的作用及其可能的途徑。
1材料和方法
(1)自由基體系
按照下列方法配制高、低濃度的羥自由基體系。高濃度：按1∶1∶1的容積比將3%的H2O2、450μm/L的FeSO4和百分之2.7的NaCl混合制成等滲、pH7.0的羥自由基體系；低濃度：按0.5∶1∶1.5的容積比將百分之3的H2O2、450μm/L的FeSO4和百分之1.8的NaCl混合制成等滲、pH7.0的羥自由基體系。分別在以上體系配制后的即刻、10min、30min和1h用自旋捕捉劑DMPO(5，5-diethyl-1-pyrroline-N-oxide)捕捉自由基，并于室溫下用ESR(electronic spinresonance)-電子自旋共振波譜儀測定(BRUKERER-200D，微波功率SP=10mW(13db)，調制幅度MA=5G，放大增益GN=5×104，中心磁場CF=3470G，掃場寬度SW=100G)，證明配制后即刻已產生自由基且在1h內其濃度不變。
(2)自由基對紅細胞的損傷及恢復
10名健康成人新鮮紅細胞(男女各5名)經等滲磷酸緩沖液(PBS)清洗兩遍后分別與以上兩自由基體系在室溫條件下作用30min。作用后的紅細胞經PBS清洗兩遍后再于室溫條件下放置3h。
(3)紅細胞流變參數測定
在前期的預實驗中，采用根據M.Paulitschke等人的微吸管技術而設計的微管細胞流變儀對自由基作用后的10只大鼠紅細胞流變性變化進行的觀察發現：當用內徑為1.6～2μm的毛細管在10cmH2O的負壓吸引下，每只隨機測定8～10個細胞，即觀察到紅細胞膜剪切彈性模量顯著增高(P<0.05)。
本研究中仍采用以上微吸管法，自由基作用前后的每份紅細胞由內徑為1.6～2μm的微吸管在8cmH2O的負壓下(ΔP)隨機吸取紅細胞懸浮液中10～12個細胞，并由圖象分析系統計算出每個紅細胞膜的剪切彈性模量、細胞表面指數等細胞流變學指標，分析紅細胞剛性化程度。圖1所示為微吸管測定紅細胞流變性的方法，先后測量微管內半徑RP、紅細胞被吸入微管內部分的長度L和紅細胞未被吸入微管部分的直徑D，經由計算機根據下列改進的M.Paulitschke]經驗公式計算紅細胞膜剪切彈性模量μ、細胞表面指數Si。膜剪切彈性模量μ增加和細胞表面指數Si下降，分別代表膜流動性降低及細胞相對體積增大，表明細胞流變性下降，反之亦然。
上式中K1=2.45，K2=0.63
(4)紅細胞膜分子流動性測定
將每份經PBS清洗兩遍后的兩個100μl紅細胞分別再懸浮于500μl的PBS中，其一加入10-3M/L的3-MCP[3-maleimdopropyl(-carbamoyl)-proxyl]8μl充分混勻，標記紅細胞膜蛋白分子；另一加入10-3mol/L的12-DSA(12-doxyl-strearic acid)20μl充分混勻，標記紅細胞膜脂質分子區。室溫標記兩小時后離心去上清。在室溫條件下用電子自旋共振波譜儀(ESR)分別測定以上標記樣品的ESR信號(除了脂質和蛋白分子標記物的SW分別為100G和50G外，其他儀器參數相同，即SP=13db，MA=5G，CF=3470G，GN=5×104)，由于標記物分子的相對旋轉時間反映這些分子運動時的周圍分子環境，因此根據下式分別計算膜蛋白(τp)及脂質分子(τl)標記物的相對旋轉時間以表示膜蛋白和脂質分子流動性：
上式中τ為分子相對旋轉時間，ΔH(0)為ESR譜的中心峰的峰-峰寬，h(1)、h(0)和h(-1)分別為低場峰、中心峰和高場峰的峰高(如圖2所示)。
(5)數據分析
用T檢驗對自由基作用后的各實驗參數與實驗前有關參數進行醫學統計學比較，設定P<0.05時具有顯著性差異，各參數以均值±標準差(±SD)表示。
2結果
表1所示為自由基作用前后紅細胞膜剪切彈性模量和細胞表面指數的比較。無論與較高濃度或較低濃度自由基作用30min均引起完整紅細胞膜的剪切彈性模量(μ)明顯增高，增幅分別為百分之49.8和百分之42.7；3h后盡管μ值有所降低，但仍明顯高于作用前。在此期間細胞表面指數無顯著改變。
自由基作用30min后無論是蛋白或脂質的標記物分子的相對旋轉時間都大幅度延長，表明被標記的膜分子有序性增加即流動性降低，其中以蛋白的變化較大；3h后，膜分子流動性有不同程度的回復，但是蛋白分子回復較少，而脂質分子流動性幾乎回復到作用前水平(表2)。
本研究中發現，自由基作用后紅細胞膜蛋白標記物3-MCP的ESR信號強度增加了數倍至十數倍(表3)，與蛋白流動性改變一樣，三小時后盡管信號強度有所回復，但仍較作用前高數倍。由于3-MCP是與細胞膜蛋白的巰基(-SH)特異性結合，因此信號的增強提示自由基損傷后紅細胞膜表面暴露的蛋白巰基數量明顯增加，說明蛋白分子結構發生了變化，而且這一變化的可逆性較差。
與對照相比，隨著自由基濃度的降低有關參數的變化程度也隨之減輕。
3討論
自由基是自然存在并是許多生理過程所需的含有不配對電子的活性物質。但產生過量或出現在不合適的細胞部位將會導致病理學改變。前期的研究發現易受自由基攻擊的生物結構是脂雙層。膜磷脂對氧自由基的攻擊非常敏感的主要原因是：一、其所含的多不飽和脂肪酸的不飽和鍵是自由基攻擊的很好的靶部位，二、分子氧在膜疏水區的溶解度高于相應的親水區。已證明在生物體中產生的氧衍生出的自由基導致了脂質過氧化、炎癥和水腫等組織損傷。缺血/再灌注后膜的完整性的破壞及游離脂肪酸的釋放與脂質過氧化物的產生相關，并由此促進水腫和花生四烯酸的代謝等病理變化。Bruch等人利用不同的電子順磁脂肪酸氧化氮探針對人工膜的研究發現，脂質過氧化引起膜內部相應部位的改變。Anne M.Phelan通過動物實驗發現，當大腦半球缺血/再灌注后只有毛細血管內皮細胞膜疏水區的氮氧自旋標記物12-DSA所指示的區域的微粘度明顯增加，而5-DSA和16-DSA所指示的膜脂質分子區有序性未發生變化，這與Zaleska等人在脂質體被自由基損傷后的發現一致。
因為在氧轉運中大量的氧反復穿過膜，并且膜含有豐富的非配對多不飽和脂肪酸，在這些脂肪酸中與C=C烯烴鍵相鄰的亞?；忠资湓?，而紅細胞內的血紅蛋白又為損傷性自由基的產生提供了氧化還原催化劑——鐵，所以紅細胞易受到過氧化損傷。當紅細胞膜受到過氧化時，自由基更易攻擊含四個或更多烯烴鍵的多不飽和膜磷脂的?；湥@些酰基鏈主要是由花生四烯酸和二十二碳四烯酸構成，過氧化終會引起這些酰基鏈中烯烴鍵的減少。
紅細胞的流變性受膜流動性、胞漿粘度和細胞體積的影響，其中一個或幾個因素發生變化都會引起整個紅細胞的變形性降低，進而影響氧轉運和微循環灌注。紅細胞膜是典型的脂雙層蛋白鑲嵌結構，部分膜蛋白構成的細胞膜骨架不僅起著支撐細胞膜、維持膜完整性的作用，其自身也可變形；同時它還起著調控和限制膜脂分子的運動空間的作用，因此是膜流動性的重要決定因素；其他膜蛋白如一些酶類、一些受體類等等除自身的旋轉運動外也發生膜上的水平運動。膜脂分子具有旋轉、鏈擺動和水平運動等三種運動方式，無論何種方式都會受到分子結構及周圍分子運動的影響。因此紅細胞膜的流動性是由膜脂分子和蛋白分子流動性及它們彼此相互作用所決定。
本文中自由基作用后紅細胞膜剪切彈性模量明顯增加而不伴有細胞指數的明顯改變說明了自由基引起細胞膜的剛性化是紅細胞流變性降低的主要原因；而自由基作用后除12-DSA指示的膜脂質分子有序性明顯增加的結果與上述作者的發現一致外，同時還發現膜蛋白分子的有序性也明顯增加，其增幅大于脂質的變化，說明脂質和蛋白分子流變學的變化共同作用于以上膜剪切彈性模量的改變。如前所述，自由基引起了膜脂質過氧化主要表現為磷脂疏水區酰基鏈中烯烴鍵的減少、分子結構的變化，此外我們的同期研究發現自由基還引起膜磷脂親水區中含磷基團的磷-氧雙鍵與磷-氧單鍵(P＝O/P-O)的比例異常，這是本文中膜脂分子流動性降低的主要原因。有意義的是本文發現在自由基作用后膜蛋白分子標記物信號強度明顯增強和標記物的強固定化同時出現，不僅提示了膜表面蛋白暴露的標記位點增加且其中的部分位點是在蛋白分子的內部，提示自由基引起了膜表面蛋白楔狀缺損的分子結構變化，這是本文中膜蛋白流動性降低的主要分子生物學基礎。
至今未曾見到有關自由基損傷后紅細胞流變性回復情況的研究報道。本文對自由基損傷后紅細胞流變性有關指標的動態觀察表明，三小時后無論是細胞膜的剪切彈性模量或膜脂質、蛋白分子流動性均有不同程度的回復，其中脂質分子流動性幾乎完全回復到作用前水平；而蛋白分子流動性回復比較小，這與蛋白分子標記信號的回復情況相似。提示自由基對紅細胞流變性的損傷是部分可逆的，這主要是由于膜脂質分子流動性的回復，而就紅細胞流變性不能完全回復的主要原因是由于自由基損傷導致了蛋白分子結構的重構(一旦蛋白分子結構發生重構，其損傷或變化則難以回復)，使蛋白分子與周圍分子的關系發生變化從而導致流動性不易回復。從本文中的結果還可看出自由基對紅細胞流變性的損傷程度與自由基濃度有關。
根據上述各點我們認為，在許多具有產生大量自由基的臨床條件下(如心肌梗塞、腦梗塞、開心手術期間的缺血/再灌注和炎性過程)，紅細胞膜上的磷脂和蛋白分子在自由基的攻擊下而發生結構的改變，這些變化不僅使分子自身的旋轉運動和鏈擺動降低，同時通過改變分子間的關系而限制周圍分子的運動，從而降低了完整紅細胞膜的流動性并終會導致紅細胞變形性的下降影響循環及微循環灌注。
國家自然科學基金、北京市自然科學基金支持項目
1995年5月30日收稿，1995年10月20日修回