趙菁 白躍宏
《中國組織工程研究與臨床康復》2009年第7期
上海交通大學附屬第六人民醫院康復科上海市200233
趙菁，女，1982年生，山東省東平縣人，漢族，上海交通大學醫學院在讀碩士，主要從事下腰痛的臨床康復研究。
通訊作者：白躍宏，博士，主任醫師，上海交通大學附屬第六人民醫院康復科，上海市200233
摘要：
背景：
端粒的長度與細胞老化、永生化、癌變有密切的關系。
目的：
探討端粒長度變化在腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征中的意義。
設計、時間及地點：
對比觀察，實驗于2007-07／2008-02在上海交通大學醫學院醫學基因組學國家實驗室完成。
對象：
25份豎脊肌組織標本取自2007-05／09，年齡29～49歲，平均（34．7±12．6）歲，其中10份為正常人標本，15份為腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛患者標本，根據年齡正常標本分為30～37歲和38～45歲2個對照組；非正常標本分為29～34歲、35～43歲和44～49歲組，每組5例。
方法：
取各組標本提取DNA，采用SouthenBloWing雜交技術，測量各組標本豎脊肌組織骨骼肌細胞端粒長度。
主要觀察指標：
患者豎脊肌組織與正常組織端粒酶長度。
結果：
腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛患者豎脊肌細胞平均端粒長度明顯比正常人豎脊肌細胞平均端粒長度短。且有顯著性差異（P＜0．05），44～49歲組較短，29～34歲組其次。
結論：
端粒的異常狀態參與腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征的發生。在腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征病變的過程中，端粒長度明顯變短，與年齡有關。
0引言
端粒是真核細胞染色體末端的一種富含鳥嘌呤的DNA-蛋白復合體，是維持染色體結構完整所需的。端粒的DNA由多種蛋白質成分組成。人體端粒DNA由6個核苷酸重復序列TTAGGG組成。端?？杀Ｗo染色體末端不被降解，防止染色體相互融合、重組，減數分裂時維持染色體正確的配對移動，并能防止DNA復制時末端序列的丟失，提高一些物種有絲分裂是染色體分離的準確性。端粒在不同物種細胞中對于保持染色體穩定性和細胞活性有重要作用。目前，檢測端粒長度（mean length of telomere restriction fragment，TRF)的變化及端粒酶的活性己成為人們研究細胞癌變、衰老和死亡的重要指標之一。
作者采用Southen Blotting雜交技術對10例正常豎脊肌組織，15例腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛患者豎脊肌細胞端粒長度進行測量。以探討其在腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛患者病變過程中骨骼肌細胞的變化，為臨床研究該疾病的病理轉歸提供實驗室依據。
1對象和方法
設計：對比觀察。
時間及地點：實驗于2007-07/2008-02在上海交通大學醫學院醫學基因組學國家實驗室（BSL-3）完成。
對象：25份豎脊肌組織標本均取自2007-05/09，年齡29～49歲，平均(34．7±12．6)歲，其中正常人標本10份，15份為腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛患者標本，按年齡將正常標本分為30～37歲和38～45歲2個對照組；非正常標本分為29～34歲、35～43歲和44～49歲組，每組5例。根據國務院《醫療機構管理條例》規定，受試者均知情同意。
實驗方法：
端粒長度檢測方法：人的端粒重復序列是TTAGGG以CCCTAA或TTAGGG為探針，通過Southern雜交就可以測出端粒長度。實驗采用TTAGGG為探針。
DNA抽提：將樣本剪成小塊，加入液氮中研磨成粉狀，酚原仿法常規抽提基因組DNA。經AmershamGene Quant Pro核算蛋白定量儀測定，所選樣品純度介于1．7～1．8，濃度＞0．5 g/L。
Southern blotting：按Telo TAGGG Telomere Lenth Assaykit所提供實驗流程進行。
①在各組樣本DNA中加入等量HinfⅠ和RsaⅠ進行酶切。
②樣品酶切后，8 g/L瓊脂糖凝膠（含0．5 g/L EB)5 V/cm電泳樣品DNA20 u和120μL Marke混合物Ⅰ0．5h。
③凝膠置于0．25mol/L HCl中脫嘌呤5～10min，變性液（0．5 mol/L NaOH，1．5 mol/L NaCl）變性30min；中和液（0．5mol/L Tris，3mol/L NaCl pH 7．5)中和20min。
④正電荷尼龍膜（0．45μm)，毛細管虹吸法轉膜。20×SSC中進行轉膜。時間6h，結束后，將膜在120℃下烘烤20min。
⑤DIG Easy Hyb液預雜交液42℃孵育1h，帶有地高辛標記探針的DIG Easy Hyb雜交液42℃水浴振蕩過夜。Anti-DIG-AP工作液的準備：為避免聚集的抗體導致背景升高，在配置前，先將抗體溶液在13000r/min下離心5 min。將Anti-DIG-AP用blocking solution，1x（Solution 11)稀釋至終濃度75 U/L（1：10．000)。
⑥Anti-DIG-AP工作液洗膜。
⑦室溫下碘化丙錠化學發光，X-ray曝光5～20min。
圖像獲取：用掃描儀將尼龍膜上的圖像掃入磁盤，用圖像分析系統進行圖像分析，圖像的吸光度值減去背景的吸光度值，對比標準Marker相對分子質量，然后用軟件計算出圖像的端粒DNA片斷長度。
主要觀察指標：患者豎脊肌組織與正常組織端粒酶長度測定結果。
設計、實施、評估者：第一作者設計試驗并實施，通訊作者評估，經過培訓。
統計學分析：由第一作者利用SPSS13．0軟件微機處理分析數據。對正常組織和慢性骨筋膜間隔綜合征組織數據作χ2檢驗、t檢驗分析。
計算端粒平均長度：按下列公式計算，L=∑（Ai×Li）/∑（Ai），雜交帶i處吸光度(Ai)、雜交帶i處吸光度（Ai）/i處DNA分子大?。↙i）（∑Ai/Li），Ai是所測條帶中對應于每一個Marker位置上的吸光度值，Li為對應的每一個Marker分子長度。
2結果
腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛患者豎脊肌組織與正常組織端粒酶長度見圖1和表1。
從表1中數據看出，正常組平均端粒長度值8.29809～8.388441kb。腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征患者組平均端粒長度值7.099784～7.423502kb，顯著縮短（P＜0.05），患者44～49歲組較短，29～34歲組其次。
其中以Li為11.28時，正常人和患者端粒DNA長度見圖2；計算平均端粒長度見圖3。
從圖2和圖3中可看到腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征組端粒長度明顯縮短。
3討論
在實驗中，15例非正常豎脊肌組織肌細胞端粒長度均明顯縮短。在非正常組中，以5組縮短比較明顯，可能與病變程度和年齡有關。Melk等研究發現，端粒長度隨年齡增加而變短。有學者研究發現Epithalon多肽具有提粒酶活性，延緩端粒變短作用?？梢姸肆５淖兌膛c端粒酶活性有密切關系。
單細胞真核生物中的端粒需要維持一定長度，而人類細胞在正常情況下是非永生的，其端粒與其他真核生物的特點也相同。端粒的長度與細胞老化、永生化、癌變有密切的關系，端粒酶的激活是端粒延長的重要原因。然而，通過反饋調節作用；將端粒維持在一定長度范圍內，如果這種監控減弱或消失，細胞的生物特性將發生改變。在中細胞真核生物中，由于端粒酶的存在，使一些生物的端粒保持在一定的長度范圍內，且不隨生長條件和培養時間而改變。這都表明在端粒長度相對穩定的細胞中存在調節端粒長度的機制。對于正常的豎脊肌細胞端粒保持一定的長度，在腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛病變發展中，其端粒參與并且逐漸變短。結合試驗可以發現，患者組端粒長度明顯變短，44～49歲組比較短，29～34歲組其次。由此預見，骨骼肌細胞端粒變短可以作為作為腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛病變程度的指標。
端粒酶是一個RNA蛋白質復合物，RNA中含有指導DNA合成的模板序列，絕大多數正常體細胞不表達端粒酶活性，少數具有增殖潛能的細胞可以有低水平的端粒酶活性表達。骨骼肌細胞是由胚胎的生肌節和各處的間充質細胞分化而成，在肌膜和基膜之間有一種體積較小的扁平或立方形細胞，稱為衛星細胞，被認為是保留在成年骨骼肌內具有增殖分化能力的肌源性干細胞。一般情況，這些細胞位于肌膜和基底膜之間，保持不分裂、靜止狀態。但是，當肌細胞受到損傷刺激時，衛星細胞即被激活、增生并表達成肌細胞標記物。后面這些細胞同原有的骨骼肌細胞相互融合，或是彼此融合，形成新的肌纖維細胞。腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征與其他部位的骨筋膜間隔綜合征病理變化相似，若得不到及時治療就會引起肌肉的變性、壞死及纖維化，在慢性骨筋膜間隔綜合征動物實驗模型中也能發現這一點。這是腰肌重復性損傷形成的重要病理原因之一。因此推測，在腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征中，骨骼肌受到損傷，在損傷部位出現組織的變性和炎癥反應同時，肌衛星細胞也會出現。在肌肉發生損傷后24h內，衛星細胞已經出現，并且由于受到損傷刺激的影響，衛星細胞已經出現了細胞核增大、DNA合成增加、細胞質含量增多和細胞質密度升高的現象，說明衛星細胞已經被激活，并開始表現出分裂利增殖，究其原因會發現細胞端粒酶活性被激活、復制。在DNA復制過程中，由于聚合酶不能復制線性染色體的5’末端，每次細胞分裂時端粒DNA就會丟失50～200bp，引起端粒縮短。
在實驗中，也發現腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛患者骨骼肌細胞的端粒長度7．099784～7．423502比較正常人端粒長度8．29809～8．388441kb明顯縮短，并且具有顯著性差異（P＜0．05)。當然端粒變短與端粒活性，年齡等也有密切關系，其過程是復雜的。這對研究腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛、認識其發病機制具有指導意義。同時也為臨床診斷腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛提供實驗室依據。腰骶部慢性骨筋膜間隔綜合征所致慢性腰痛疾病的發生是一個復雜的過程，對其深入認識尚有待于進一步研究。