北京生物醫學工程2000年第2期第19卷論著
作者：施巖孫大公陳凱謝利德姚偉娟文宗曜
單位：施巖(承德醫學院數學教研室承德067000)；
孫大公陳凱謝利德姚偉娟文宗曜
(北京醫科大學血液流變學研究中心北京100083)
關鍵詞：戊二醛；膜蛋白；新激光衍射法；生物力學特性
摘要
本文通過不同濃度戊二醛作用于紅細胞膜。用新型激光衍射法測量了這些紅細胞樣品的彈性模量E和膜粘度μm。同時通過DPH標記的螢光偏振法測定了這些紅細胞膜的流動性，并采用MSL標記的電子自旋共振波譜技術(ESR)測量了紅細胞膜蛋白運動性的變化，并取得了與新型激光衍射法一致的結果。發現膜蛋白構象發生改變，膜脂流動性下降，紅細胞膜剪切彈性模量(E)和表面粘度(μm)均呈上升趨勢，紅細胞變形能力下降。并對上述紅細胞膜結構改變所引起的微觀流變特性的變化進行了初步探討。
0前言
紅細胞膜的力學性質主要由膜骨架的結構決定，如果構成膜骨架的各種蛋白相互之間的作用異?；蚰撤N蛋白有缺陷均可引起紅細胞膜力學性質的改變，從而引發多種疾病。如遺傳性球形紅細胞增多癥(HS)、陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)等都是由于膜蛋白的缺陷或異常引起的。日本學者Manno等人研究了骨架蛋白磷酸化和完整細胞膜的功能之間的關系，他們認為細胞膜力學穩定性受膜酪蛋白激酶I對beta-spectrin的磷酸化調控，beta-spectrin的磷酸化降低增加了細胞膜的力學穩定性；反之磷酸化程度的增加降低了細胞膜的力學穩定性。An XL和Takakuwa等人研究了紅細胞膜蛋白4.1和帶3蛋白相互作用對膜力學性質的影響，他們發現隨著蛋白4.1與帶3蛋白的分離，帶3蛋白與錨蛋白的相互作用增強，使細胞膜的變形性下降，機械穩定性增加。Gwozdzinski等人利用電子共順磁共振技術研究了慢性腎衰竭病人的紅細胞膜性質，發現慢性腎衰竭病人的紅細胞的滲透脆性比正常人有顯著增加，而且膜蛋白的運動性下降。即便在正常生理過程中隨紅細胞的衰老，紅細胞膜結構也在不斷發生變化，導致紅細胞剛性增加，終會被從血液循環系統中清除掉。我們曾先后研究了缺鐵性貧血大分子吸附，白蛋白對紅細胞微觀流變特性的影響及胰蛋白酶對紅細胞膜的水解作用。本文通過戊二醛作用于紅細胞膜，通過DPH標記的螢光偏振法測定了這些紅細胞膜的流動性，采用MSL標記的電子自旋共振波譜技術(ESR)測量了紅細胞膜蛋白的構象的動態變化，并用新型激光衍射法測量了這些紅細胞樣品的彈性模量E和膜粘度μm。獲得對紅細胞力學性質的定量描述。
1材料與方法
1.1實驗動物、試劑與儀器
北京大白兔，由北京醫科大學實驗動物部供給；戊二醛(Glutaraldehyde)；馬來酰亞胺(MSL，Sigma公司)；DPH(NULL，6-二苯基1，3，5-乙三烯，Sigma公司)；聚乙烯吡咯烷酮PVP(polyvinlpyrolidone，分子量為30kD)。
BrukerESP300型電子自旋共振波譜儀；日立(HITACHI)850型熒光分光光度計；GYJ-I型自動激光衍射，北京醫科大學與北京地質儀器廠聯合研制；低溫高速離心機LG10-3A北京醫用離心機廠
1.2方法與步驟
1.2.1紅細胞膜(resealed ghost)制備
大白兔頸動脈插管取血，肝素抗凝，離心去血漿及白細胞，加入等滲PBS離心，去上清，重復2次，得紅細胞。將pH7.9的低滲緩沖液在4℃左右按40∶1的體積加入紅細胞中，使之溶血，用高速冷凍離心機在12000rpm下離心，棄上清，如此重復4次，得白色細胞膜放入pH7.4的等滲PBS中使之封閉。
1.2.2用電子自旋共振波譜技術(ESR)測量經戊二醛處理、馬來酰亞胺(MSL)標記的紅細胞膜蛋白構象及運動性的變化。
取細胞膜5份，每份200μl，分別用濃度為0、1/4000、1/3000、1/2000、1/1000(V/V)的戊二醛PBS緩沖液懸浮5min，然后立刻離心去上清，再用等滲PBS離心洗滌三次，以終止反應。
將15μl的馬來酰亞胺(MSL)溶于800μl的PBS后加入各份樣品中進行標記，在冰水中攪拌4min，置于4℃冰箱過夜。上機測試前用PBS洗滌膜3～4次(10000rpm，10min)。
1.2.3用熒光偏振法測定經戊二醛處理的紅細胞膜脂流動性
用濃度為0、1/4000、1/3000、1/2000、1/1000和1/500的戊二醛處理細胞膜5min，然后迅速離心清洗終止反應。每份樣品含400μg蛋白。
用熒光探劑DPH標記紅細胞膜及上機測量熒光偏振度(P)。
1.2.4用新型激光衍射法測定經戊二醛處理的紅細胞在C=0軌道上的小變形(DId)
兔耳緣取血，離心后去血漿及白細胞等，然后用等滲PBS離心清洗得純凈的紅細胞。
用戊二醛濃度分別為0、1/4000、1/3000、1/2000、1/1000的PBS緩沖液懸浮紅細胞，細胞濃度為2×107個/ml，處理5min后迅速離心終止反應。
測量紅細胞平均直徑。
將處理過的紅細胞分別用百分之3的PVP溶液(分子量30kD，其中含百分之0.04的牛血清白蛋白)懸浮，用新型激光衍射法測量紅細胞在C=0軌道上的小變形(DId)，測試條件為：剪切率=200s-1。
1.2.5用傳統激光衍射法測定經戊二醛處理的紅細胞在高粘流場中大的變形指數(DImax)及變形恢復半衰減時間(t0.5)。
紅細胞準備同(1.2.4)。
用戊二醛處理紅細胞同(1.2.4)。
經戊二醛處理后的紅細胞用百分之15PVP懸浮，紅細胞濃度仍為2×107個/ml，用激光衍射法測量(i)紅細胞較大變形指數(DImax)；(ii)紅細胞變形恢復半衰減時間(t0.5)，測量條件為：較大切變率為1000s-1。
2結果與討論
經戊二醛處理后，紅細胞膜的電子自旋共振譜的蛋白強弱固定比(S/W)結果如圖1所示。由圖可以看出，S/W值隨戊二醛濃度的增加而顯著增大，表明經戊二醛作用后，紅細胞膜蛋白運動性下降。戊二醛是一種常用的同型雙功能交聯劑，它的兩個醛基可以與兩個相同或不同分子上的伯氨基形成Schiff氏堿，將兩分子以五碳鏈的橋聯接起來。經戊二醛處理后，紅細胞膜蛋白產生不同程度的交聯，這種交聯作用對紅細胞膜上的蛋白空間取向、彼此間的相互作用勢必產生影響。由于橋聯的作用膜蛋白彼此間的約束加強，膜蛋白三級結構趨于收縮。
采用熒光偏振技術測量的經戊二醛處理后的紅細胞膜的熒光偏振度(P)，隨戊二醛的劑量增加而上升，結果如圖2，說明脂流動性下降。由于膜蛋白與膜脂的相互作用，膜蛋白產生不同程度的交聯后進而影響了膜脂的流動性。隨交聯程度的增加對膜脂的流動性影響越大，然而比較圖1和圖2，可以看到，S/W值的變化趨勢與P值的變化趨勢是不同的，說明膜蛋白的變化對膜脂流動性的影響是非線性的。
利用文宗曜等人提出的新型激光衍射法，我們測定了經不同濃度戊二醛處理的紅細胞在低粘低切變(η=3cp，γ=200s-1)流場中C=0軌道上的小變形DId，結果見表1。同時測量了經不同濃度戊二醛處理后的兔紅細胞直徑，平均值為6.5±0.5μm。
利用施巖等人提出的公式：
分別代入不同戊二醛濃度下的小變形值DId以及紅細胞平均半徑，計算出不同戊二醛濃度下紅細胞的剪切彈性模量(E)，結果如圖3。
利用傳統激光衍射法我們分別測得不同戊二醛濃度下的紅細胞變形恢復半衰減時間t0.5，及紅細胞大的變形指數DImax，結果見表1。
根據施巖等人提出的公式：
將已獲得的E和t0.5代入上式，即可求得不同濃度戊二醛作用下紅細胞膜粘度(μm)，結果見圖4。
由圖3、4的結果可知，隨著膜蛋白交聯程度的增加，導致膜剪切彈性模量(E)上升，即紅細胞膜剛性程度上升，紅細胞粘度(μm)也明顯上升。膜剪切彈性模量(E)和膜粘度(μm)主要由紅細胞膜蛋白的性質決定，利用傳統激光衍射法只能獲得紅細胞變形性的相對量DImax，而用新型激光衍射法我們獲得了描述紅細胞微觀力學性質的物理量，說明新型激光衍射法在研究紅細胞微觀力學性質上比利用傳統激光衍射法更為優越。E和μm的增加導致了紅細胞變形能力的下降。
綜上所述，戊二醛作用于紅細胞膜后造成膜蛋白交聯，蛋白間結合位點增多導致膜蛋白運動性下降，構象發生改變，蛋白三級結構趨于收縮；在膜蛋白交聯作用的影響下膜脂流動性降低；紅細胞膜剪切彈性模量(E)和表面粘度(μm)均呈上升趨勢，紅細胞剛性增加，紅細胞變形能力下降。用新型激光衍射法測得的膜剪切彈性模量(E)和表面粘度(μm)，很好地證明了戊二醛作用于紅細胞膜蛋白使之交聯而產生的膜蛋白構象的改變。
作者簡介：孫大公(1966-)，男，北京醫科大學醫學物理教研室講師。