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《華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》1999年第1期
馮興民陳槐卿
華西醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究室
內(nèi)容摘要
利用不同濃度的趨化物質(zhì)N-甲酰甲硫亮氨酰苯丙氨酸(fMLP)處理中性粒細(xì)胞，并采用硝基藍(lán)四唑(NBX)還原法檢測中性粒細(xì)胞激活率，結(jié)合流室系統(tǒng)定量地研究了在不同切應(yīng)力作用下，不同激活狀態(tài)的中性粒細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)粘附的關(guān)系。通過顯微鏡觀察、計數(shù)及統(tǒng)計分析，結(jié)果表明：隨著fMLP濃度的增加，中性粒細(xì)胞激活率顯著增加，兩者有著明顯的量效關(guān)系。
該實(shí)驗(yàn)還表明：中性粒細(xì)胞經(jīng)fMLP處理后，與對照組一樣，隨著切應(yīng)力增加，中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附率按指數(shù)曲線下降；中性粒細(xì)胞激活率的增加可以引起中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附顯著增加，當(dāng)切應(yīng)力由小變大時，這種作用有減緩的趨勢。以上結(jié)果提示：
①體內(nèi)血流產(chǎn)生的切應(yīng)力可能是阻止中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附的重要因素，中性粒細(xì)胞粘附隨切應(yīng)力增加而減少有利于體內(nèi)正常血液循環(huán)的維持；
②中性粒細(xì)胞激活可以增加其對內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。
關(guān)鍵詞：中性粒細(xì)胞；激活；粘附；甲酰甲硫亮氨酰苯丙氨酸；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞
許多研究結(jié)果表明白細(xì)胞(尤其是中性粒細(xì)胞)激活，以及白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相萬作用，在心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。但是，國內(nèi)外現(xiàn)階段只局限于單獨(dú)研究白細(xì)胞的激活或白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，而把白細(xì)胞激活結(jié)合白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附研究的報道尚未見到。為此，我們從細(xì)胞流變學(xué)角度探討中性粒細(xì)胞激活與中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附的相關(guān)性，以期進(jìn)一步闡明中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的機(jī)理，探討腦血管疾病的發(fā)病機(jī)理。
1實(shí)驗(yàn)材料與方法
1．1實(shí)驗(yàn)材料
1．1．1主要試劑
胰蛋白酶(Sigma公司)，M199培養(yǎng)液(GibicoBRL)，膠原酶(Sigma公司)，甲酰甲硫亮氨酰苯丙氨酸(fMLP)(Sigma公司)，硝基藍(lán)四唑(NBT)(Fluka AG)，淋巴細(xì)胞分離液(比重1．077，上海試劑二廠)。
1．1．2實(shí)驗(yàn)裝置
參見文獻(xiàn)。
1．2實(shí)驗(yàn)方法
1．2．1胎兒臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
按Jaffe等的方法培養(yǎng)原代胎兒臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(圖1)。細(xì)胞長滿并融合為單層時進(jìn)行消化傳代，接種于22×11mm2蓋玻片上。透射電鏡下胞漿有內(nèi)皮細(xì)胞特異性的Weibel-Palade小體(圖2)。
1．2．2中性粒細(xì)胞懸液的制備
將健康人血(肝素抗凝，201U/ml)低速離心棄去富血小板血漿，余血用右旋糖酐Dexrran200沉降紅細(xì)胞，將上層細(xì)胞懸液置于淋巴細(xì)胞分離液(比重1．077)上，離心后取底部細(xì)胞并用0．2％NaCl破壞混雜的紅細(xì)胞，再用Hanks液清洗二遍后，懸浮于含2％小牛血清的Hanks液中，并調(diào)至2×106/ml。分類計數(shù)中性粒細(xì)胞占95％以上，細(xì)胞完整，臺盼藍(lán)試驗(yàn)表明99％為活細(xì)胞。
1．2．3中性粒細(xì)胞激活的測定
加0．2ml中性粒細(xì)胞懸液于干凈、硅化的小塑料試管中，再加等量的0．1％NBT溶液，然后在37℃孵育20分鐘，接著在室溫(22℃)靜置10分鐘，取底部細(xì)胞涂片、瑞氏染色，在×100倍油鏡下計數(shù)100個中性粒細(xì)胞，其中胞漿有藍(lán)黑色從(formazan)沉淀者為NBT陽性(激活)中性粒細(xì)胞。由此可計算出激活中性粒細(xì)胞的百分率。
1．2．4實(shí)驗(yàn)分組
實(shí)驗(yàn)分為對照組、10[-9]mol/L fMLP組(Ⅰ)、10[-8]mol/LfMLP組(Ⅱ)、10[-7]mol/L fMLP組(Ⅲ)，共四組。每組各10例(見附表)。
1．2．5實(shí)驗(yàn)操作
各實(shí)驗(yàn)組在中性粒細(xì)胞懸液加入Hanks液或fMLP后，孵育15分鐘，取少量做NBT染色，以測定中性粒細(xì)胞的激活率。剩余的中性粒細(xì)胞懸液用作粘附特性測定。
將長有內(nèi)皮細(xì)胞的蓋玻片放入流室內(nèi)并密封，緩慢注入經(jīng)上述處理后的中性粒細(xì)胞懸液。在37℃5％CO2孵箱孵育20分鐘后，取出并安裝到顯微鏡操作臺上。用M199培養(yǎng)液(含2％的新生小牛血清)，以0．05Pa的切應(yīng)力作用10分鐘以沖走未粘附的中性粒細(xì)胞，再依次用0．1、0．15、0．2、0．25、0．5、1．0Pa切應(yīng)力分別作用2分鐘，觀察并錄像。分別計數(shù)各組在不同切應(yīng)力條件卜中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的數(shù)目(取10個隨機(jī)視野的平均數(shù))，并求得粘附百分率，即：
1．2．6統(tǒng)計學(xué)處理
所得數(shù)據(jù)作多個樣本均數(shù)的F檢驗(yàn)，并以q檢驗(yàn)作兩兩比較。
2結(jié)果
2．1 fMLP對中性粒細(xì)胞激活的影響
不同濃度的fMLP對中性粒細(xì)胞激活的影響情況見圖3。
由圖3可見，隨著fMLP濃度的增加，中性粒細(xì)胞激活率也增加，二者有顯著的量效關(guān)系。對照組的中性粒細(xì)胞激活率明顯低于其它三組(P<0．01)，而fMLP三個不同濃度組之間差異均有顯著性(P<0．01)。
2．2 fMLP對中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附率的影響
不同切應(yīng)力下不同濃度的fMLP對中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響情況見圖4。由圖4可見，加入fMLP各組較對照組的粘附率增加，有顯著性差異(P<0．01)，Ⅲ組(fiMLP=10[-7]mol/L)較Ⅰ組(fMLP=10-9mol/L)和Ⅱ組(fMLP=10-8mol/L)中性粒細(xì)胞粘附率顯著增加(P<0．01)。
根據(jù)圖4，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合有如方程：
式中Y為中性粒細(xì)胞粘附率(％)，X為切應(yīng)力(％)。
上述四式可概括為Y=e（a-bx），則a、b為粘附特征常數(shù)。
由此可以看出，隨著切應(yīng)力增大，各組中性粒細(xì)胞粘附率呈指數(shù)曲線下降。若以0．05Pa切應(yīng)力剪切后粘附的中性粒細(xì)胞數(shù)為100％，則可得出切應(yīng)力與中性粒細(xì)胞相對粘附率的關(guān)系(圖5)，隨著切應(yīng)力增大，中性粒細(xì)胞相對粘附率逐漸下降，各組均在0．05～0．25Pa段下降較快，以后下降速度減慢。由圖5可得出使粘附的中性粒細(xì)胞數(shù)減少一半的切應(yīng)力四組分別為0．17Pa、0．25Pa、0．30Pa、0．35Pa。
2．3中性粒細(xì)胞激活率與中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附率的關(guān)系
對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，可以獲得中性粒細(xì)胞激活率與中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附率的關(guān)系圖(圖6所示)。由圖中可見，隨著中性粒細(xì)胞激活率的增加，中性粒細(xì)胞粘附率呈直線增加。
三條直線分別代表如下回歸方程：
0．05Pa：Y＝9．6601+0．5154X r=0．9913
0．25Pa：Y=1．8951+0．4645X r=0．9957
1．00Pa：Y=0．4034+0．2435X r=0．9991
式中Y為中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附率(％)，X為中性粒細(xì)胞激活率(％)。
3討論
從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著fMLP濃度的增加，中性粒細(xì)胞激活率顯著增加，fMLP是一種強(qiáng)力化學(xué)趨化肽，它被證明能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞表面CD11/CD18表達(dá)，屬速發(fā)反應(yīng)。
本實(shí)驗(yàn)中不管是對照組還是三種不同濃度fMLP組均存在著這種現(xiàn)象，隨著切應(yīng)力加大，中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附呈指數(shù)曲線減少。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Lawrence等及Kuijper等報道一致，提示體內(nèi)切應(yīng)力比較低的毛細(xì)血管后微靜脈和小靜脈是中性粒細(xì)胞易粘附的部位，而體內(nèi)血流產(chǎn)生的切應(yīng)力可能是阻止中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的重要因素，粘附隨切應(yīng)力增加而減少有利于機(jī)體正常血液循環(huán)的維持。
本文用經(jīng)驗(yàn)公式來表達(dá)切應(yīng)力與中性粒細(xì)胞粘附率的關(guān)系，找出粘附特征參數(shù)a、b值。a值與初始粘附有關(guān)，b值與切應(yīng)力從小變大時中性粒細(xì)胞粘附減少的速率有關(guān)。a、b值能反映不同條件下中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附的特征。對照組初始粘附值較小，而當(dāng)切應(yīng)力從小變大時，其中性粒細(xì)胞粘附減少速率快。而Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組初始粘附值均比對照組大，當(dāng)切應(yīng)力由小變大時，中性粒細(xì)胞粘附減少速率比對照組慢。
我們的實(shí)驗(yàn)還觀察到，中性粒細(xì)胞激活率的增加，可以引起顯著的中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附增加，而在比較高的切應(yīng)力下中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附隨中性粒細(xì)胞激活率增高而增加的速率有減緩趨勢，這主要表現(xiàn)在高切應(yīng)力下的中性粒細(xì)胞激活-粘附直線的斜率變小。這說明了切應(yīng)力對于減少粘附的重要作用。
基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(批準(zhǔn)號：39670202)
作者單位：馮興民(華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床微循環(huán)實(shí)驗(yàn)室)
陳槐卿(華西醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究室成都610041)