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季永喻田
《國(guó)外醫(yī)學(xué).麻醉學(xué)與復(fù)蘇分冊(cè)》2004年06期
【作者單位】：遵義醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)系
【摘要】：
線粒體DNA(mitochondrical DNA，mtDNA)是僅有的存在細(xì)胞核以外的遺傳物質(zhì)。自由基是造成mtDNA損傷的主要原因，以線粒體DNA點(diǎn)突變和缺失突變多見(jiàn)。mtDNA損傷可以導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化功能障礙、細(xì)胞凋亡和死亡，引起對(duì)能量需求較高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉等組織出現(xiàn)功能障礙甚至疾病。
線粒體DNA(mitochondrical DNA，mtDNA)是惟一存在細(xì)胞核以外的遺傳物質(zhì)，長(zhǎng)度為16569bp，編碼區(qū)共37個(gè)基因，編碼22個(gè)tRNA基因，2個(gè)rRNA基因，13個(gè)與線粒體氧化磷酸化有關(guān)的蛋白質(zhì)基因，均為線粒體蛋白質(zhì)合成所必需。在核基因調(diào)控下控制氧化磷酸化和ATP的合成及自我更新，維持線粒體基本功能。研究表明線粒體DNA損傷主要是由自由基造成的，核酸分子損傷后一般不降解而被直接修復(fù)，未被修復(fù)的損傷DNA片段可積累下來(lái)，造成進(jìn)一步更大的損害，從而導(dǎo)致器官功能障礙。大量研究發(fā)現(xiàn)mtDNA氧化損傷與腫瘤、線粒體肌病、神經(jīng)變性疾病和衰老密切相關(guān)。本文就這一氧化損傷發(fā)生、發(fā)展及防御機(jī)制的研究情況綜述如下。
人體內(nèi)自由基的90％來(lái)源于線粒體，而mtDNA直接暴露于氧化磷酸化過(guò)程中產(chǎn)生的高反應(yīng)性氧中，缺乏組蛋白及其他結(jié)合蛋白的保護(hù)，缺乏完善的損傷修復(fù)系統(tǒng)，致使氧化損傷成為mtDNA突變的主要原因，所以mtDNA比核DNA突變率高5～17倍。
1自由基的產(chǎn)生
自由基(free radical)是具有一個(gè)不配對(duì)電子的原子和原子團(tuán)的總稱(chēng)。引起人體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生的原因很多。一方面，由紫外線和射線的照射、臭氧、大量體育運(yùn)動(dòng)、藥物、酒精、吸煙等外來(lái)因素引發(fā)的自由基稱(chēng)為“外源性自由基”；另一方面，在新陳代謝過(guò)程中由人體內(nèi)生化反應(yīng)所產(chǎn)生的自由基稱(chēng)為“內(nèi)源性自由基”。本文重點(diǎn)討論內(nèi)源性自由基產(chǎn)生的機(jī)制。
1．1自由基產(chǎn)生的線粒體機(jī)制
1971年Loschen年先發(fā)現(xiàn)線粒體呼吸鏈能產(chǎn)生氧自由基，研究表明人體90％的自由基是由線粒體產(chǎn)生的。生理狀況下，有1％～2％的氧接受一個(gè)電子生成O2，或再接受一個(gè)電子生成H2O2。線粒體呼吸鏈可能通過(guò)“滲漏機(jī)制”產(chǎn)生氧自由基，復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ是電子漏(electronleak)產(chǎn)生的主要部位，“漏出”的電子直接和氧結(jié)合形成超氧自由基。
1．2黃嘌呤氧化酶途徑
缺血、休克等病理?xiàng)l件下黃嘌呤脫氫酶(xanthinedehydrogenase，XD)大量轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤氧化酶(xanthine ocidase，XO)。降解ATP依次為ADP、AMP和次黃嘌呤，再轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩幔磻?yīng)中組織內(nèi)O2-、OH·等氧自由基大量增加。
1．3花生四烯酸(AA)途徑
缺血再灌注時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，激活了鈣依賴(lài)的磷脂酶，引發(fā)花生四烯酸(AA)代謝。通過(guò)環(huán)氧合酶和脂氧合酶的作用產(chǎn)生大量的OH·和H2O2。
1．4 NO合成酶(NOS)途徑
NO是活性氮的前體，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等許多細(xì)胞中，由NO合成酶催化合成。過(guò)量的NO與氧迅速反應(yīng)生成NO-、NO2、NO3-等。這些是強(qiáng)效氧化劑，能自由彌散通過(guò)胞膜，抑制細(xì)胞線粒體呼吸，減少ATP生成，引起組織損害。
另外炎癥反應(yīng)引起的中性粒細(xì)胞激活，殺滅病原微生物同時(shí)可形成大量氧自由基；各種應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致兒茶酚胺增加，產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的氧自由基。
2自由基引起mtDNA損傷的實(shí)質(zhì)
自由基對(duì)DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類(lèi)等生物分子發(fā)生攻擊的過(guò)程中，主要發(fā)生氫抽提反應(yīng)、電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)、加成反應(yīng)、終止反應(yīng)及歧化反應(yīng)等5種基本的自由基反應(yīng)。
2．1羥自由基
攻擊堿基時(shí)，主要是·OH加成于富含電子的DNA雙鏈，尤其在嘌呤N-7-C-8位點(diǎn)和嘧啶5、6-位點(diǎn)上；攻擊糖基時(shí)，脫氧核糖鏈上一核糖被提取氫，導(dǎo)致鏈斷裂，堿基逸失。這些堿基、糖基的改變可導(dǎo)致mtDNA點(diǎn)突變、缺失和插入突變，其中以片段缺失多見(jiàn)。
2．2氮氧自由基ONOO-
氮氧自由基可與H2O2形成1-O2，使DNA脫氨基生成黃嘌呤、次黃嘌呤，形成A-T、G-C的堿基突變，還可以增強(qiáng)線粒體氧化應(yīng)激，及細(xì)胞對(duì)過(guò)氧化物介導(dǎo)損傷的敏感性。
2．3單線態(tài)氧
Cl-與H2O2反應(yīng)生成OCl-，再與H2O2生成單線態(tài)氧，氧化DNA的鳥(niǎo)嘌呤。
2．4脂性自由基
據(jù)推測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中產(chǎn)生的LO·LOO·等自由基可以發(fā)揮與羥自由基相似的DNA攻擊作用。
在生理情況下由于細(xì)胞內(nèi)存有超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glrtathione peroxidase，GSH-PX)等抗氧化酶類(lèi)可以及時(shí)清除自由基，保護(hù)機(jī)體。在病理?xiàng)l件下，由于活性氧產(chǎn)生的過(guò)多或抗氧化酶類(lèi)活性下降，則可引發(fā)以上所述鏈?zhǔn)竭^(guò)氧化反應(yīng)損傷線粒體DNA，進(jìn)而導(dǎo)致各種線粒體DNA的損傷突變。
3線粒體DNA損傷的生物學(xué)標(biāo)記
自由基在攻擊線粒體DNA的生化反應(yīng)中，常常在線粒體DNA雙環(huán)結(jié)構(gòu)中留下?lián)p傷的痕跡即損傷的生物學(xué)標(biāo)記。在對(duì)線粒體DNA損傷研究中，尋找氧化損傷的生物標(biāo)志物非常重要，例如反映mtDNA鏈斷裂、8羥基脫氧鳥(niǎo)嘌呤(8-OHdG)的測(cè)定；反映DNA修復(fù)與代謝酶多態(tài)性指標(biāo)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTS)及乙酰化酶(NATS)等的測(cè)定；近期研究表明，5羥甲基尿嘧啶也可以作為人類(lèi)氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物。目前8-OH dG是更常用可靠的mtDNA損傷的生物標(biāo)志物。
4線粒體DNA損傷的修復(fù)機(jī)制
過(guò)去多數(shù)學(xué)者認(rèn)為mtDNA缺乏修復(fù)機(jī)制。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)線粒體還是具有一定的DNA氧化損傷修復(fù)能力，但是這種機(jī)制并不完善。修復(fù)效率不如核DNA。
總之，線粒體中雖然存在某些DNA修復(fù)酶以防止突變發(fā)生，但缺乏校正閱讀功能且清除突變堿基的能力較低，結(jié)果使突變率增高，大約是核基因突變的10～17倍。
5線粒體DNA損傷的種類(lèi)
線粒體DNA病理?yè)p傷導(dǎo)致的mtDNA突變主要分為以下3類(lèi)：在編碼序列或tRNA、rRNA基因中發(fā)生點(diǎn)突變；mtDNA大段缺失，即丟失了一個(gè)以上的基因，如編碼序列、tRNA序列的缺失；線粒體DNA丟失。
5．1線粒體DNA點(diǎn)突變
5．1．1編碼蛋白基因的點(diǎn)突變是一種酶的生物缺陷
Leber氏遺傳性視神經(jīng)病是mtDNA11778位點(diǎn)的G-A突變，使ND4亞單位的精氨酸轉(zhuǎn)變成為組氨酸，導(dǎo)致復(fù)合體Ⅰ功能減退。
5．1．2 tRNA的點(diǎn)突變
常見(jiàn)位于線粒體的tRNA-Leu（UUR）基因上3243位點(diǎn)的A突變成G，該突變可阻礙mtDNA編碼的蛋白合成，并可嚴(yán)重導(dǎo)致rRNA轉(zhuǎn)錄終止，常見(jiàn)于線粒體神經(jīng)肌肉性疾病，如線粒體肌病、線粒體性腦病、乳酸中毒、中風(fēng)樣發(fā)作綜合征(MELAS)。
5．1．3線粒體核糖體RNA基因的突變
線粒體rRNA基因的12 SrRNA基因上第1555位A到G的突變，影響蛋白質(zhì)的翻譯，導(dǎo)致了母系遺傳的氨基甙類(lèi)誘導(dǎo)的耳聾和家族性耳聾。
5．2缺失突變
缺失突變不僅見(jiàn)于線粒體疾病，還可見(jiàn)于正常衰老組織。由于mtDNA特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，缺失可影響細(xì)胞的能量代謝。據(jù)病理分類(lèi)主要有2類(lèi)缺失。
5．2．1單個(gè)缺失
缺失的分子數(shù)量常占總mtDNA的20％～80％，常見(jiàn)于慢性進(jìn)行性外眼肌麻痹(COEP)，Kearns Sayre綜合征(KSS)及Pearson’s綜合征。
5．2．2多重缺失
常見(jiàn)于組織的正常衰老過(guò)程，如骨骼肌、心肌及腦。通常有以下2種：
①mtDNA4977缺失是正常衰老組織中積累常見(jiàn)的缺失，缺失位點(diǎn)為8483bp～13459bp，位于編碼ATPase8和ND5基因之間。在神經(jīng)和肌肉組織中mtDNA-4977缺失水平更高。
②mtDNA7436缺失位點(diǎn)為8649bp～16084bp，編碼復(fù)合體Ⅰ的5個(gè)亞單位，復(fù)合體Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的各一個(gè)亞單位，也是常見(jiàn)的一種缺失。
5．3線粒體DNA丟失
一些非致命性呼吸衰竭、肝功能衰竭、腎功能衰竭以及乳酸酸中毒病人的組織細(xì)胞中常見(jiàn)線粒體DNA丟失，造成線粒體形態(tài)學(xué)改變、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。
6線粒體DNA損傷的結(jié)果
由于線粒體呼吸鏈功能在細(xì)胞基本新陳代謝中的重要作用，編碼線粒體呼吸鏈復(fù)合物的mtDNA發(fā)生氧化損傷，突變mtDNA數(shù)量超過(guò)一定閾值，其結(jié)果必將導(dǎo)致DNA表達(dá)異常、細(xì)胞的能量危機(jī)。
6．1由于mtDNA中各基因排列緊密，除mtDNA的D環(huán)一小段區(qū)域外，其他序列無(wú)內(nèi)含子，且部分區(qū)域出現(xiàn)基因的重疊，因此，mtDNA的任何突變都會(huì)累及基因組中的一個(gè)重要功能區(qū)域。研究表明線粒體DNA損傷后呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ活性顯著下降，氧化磷酸化功能受損，ATP合成減少。突變導(dǎo)致構(gòu)成線粒體的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)運(yùn)輸機(jī)制及離子通道有缺陷，就會(huì)產(chǎn)生“代謝性疾病”。
6．2線粒體可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著十分重要的作用。病理?xiàng)l件下線粒體生成大量自由基，線粒體DNA廣泛突變，線粒體電子傳遞中斷、能量生成障礙均可誘發(fā)細(xì)胞凋亡。對(duì)線粒體腦、肌病的研究表明，mtDNA缺失>40％或tRNA點(diǎn)突變>70％時(shí)可在肌纖維觀察到凋亡。證明線粒體DNA突變致呼吸鏈功能障礙可能是凋亡發(fā)生的病理基礎(chǔ)。
6．3缺失突變常使mtDNA片段游離于胞質(zhì)中，如不被代謝，游離的mtDNA片段穿過(guò)核孔，穩(wěn)定地整合到核基因組中，其過(guò)程與病毒DNA插入哺乳類(lèi)細(xì)胞染色體DNA相似。有研究已經(jīng)在人胚胎、白細(xì)胞、幾種人細(xì)胞系的基因組DNA中檢出mtDNA片斷，發(fā)現(xiàn)HelaTG細(xì)胞中c-myc原癌基因有編碼細(xì)胞色素c氧化酶亞單位Ⅲ基因序列。這種插入常引起核基因的異常表達(dá)、癌基因活化和抑癌基因滅活而誘發(fā)腫瘤。如果這種插入激活了核基因的衰老相關(guān)基因，會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞的衰老進(jìn)程。
7針對(duì)線粒體DNA損傷的保護(hù)措施及治療
由于對(duì)線粒體疾病的致病機(jī)制還缺乏完善的了解，現(xiàn)在還沒(méi)有有效的針對(duì)性治療措施。目前常用的一般治療措施是增加膜穩(wěn)定性，增加呼吸鏈酶活性，如輔酶Q10；自由基清除劑，如：VC、VE、谷胱甘肽；中藥治療，如：五子衍宗丸。
7．2特殊治療
研究證實(shí)150多種疾病與mtDNA損傷、突變有關(guān)。Sherratt等認(rèn)為線粒體病的治療可以從3個(gè)方面進(jìn)行代謝治療、成肌細(xì)胞互補(bǔ)、基因治療。
綜上所述，線粒體DNA有其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，在維持細(xì)胞能量代謝中起著重要作用。隨著對(duì)mtDNA研究的進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)mtDNA損傷與線粒體腦病、肌病、代謝性疾病、糖尿病、衰老退行性疾病、腫瘤等有著廣泛的聯(lián)系，是這些疾病的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。從1988年初次發(fā)現(xiàn)mtDNA病理突變至今，人們?cè)谶@一領(lǐng)域的研究不足20年，對(duì)其確切機(jī)制仍然了解不夠，更缺乏安全有效的治療手段。因此針對(duì)線粒體DNA損傷的研究有著十分重要的意義。對(duì)不同線粒體DNA病理突變致病的分子生物學(xué)機(jī)制的研究及其針對(duì)性的預(yù)防和基因治療措施將是未來(lái)研究的主攻方向。