季永喻田
《國外醫(yī)學.麻醉學與復蘇分冊》2004年06期
【作者單位】：遵義醫(yī)學院麻醉學系
【摘要】：
線粒體DNA(mitochondrical DNA，mtDNA)是僅有的存在細胞核以外的遺傳物質(zhì)。自由基是造成mtDNA損傷的主要原因，以線粒體DNA點突變和缺失突變多見。mtDNA損傷可以導致線粒體氧化磷酸化功能障礙、細胞凋亡和死亡，引起對能量需求較高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉等組織出現(xiàn)功能障礙甚至疾病。
線粒體DNA(mitochondrical DNA，mtDNA)是惟一存在細胞核以外的遺傳物質(zhì)，長度為16569bp，編碼區(qū)共37個基因，編碼22個tRNA基因，2個rRNA基因，13個與線粒體氧化磷酸化有關的蛋白質(zhì)基因，均為線粒體蛋白質(zhì)合成所必需。在核基因調(diào)控下控制氧化磷酸化和ATP的合成及自我更新，維持線粒體基本功能。研究表明線粒體DNA損傷主要是由自由基造成的，核酸分子損傷后一般不降解而被直接修復，未被修復的損傷DNA片段可積累下來，造成進一步更大的損害，從而導致器官功能障礙。大量研究發(fā)現(xiàn)mtDNA氧化損傷與腫瘤、線粒體肌病、神經(jīng)變性疾病和衰老密切相關。本文就這一氧化損傷發(fā)生、發(fā)展及防御機制的研究情況綜述如下。
人體內(nèi)自由基的90％來源于線粒體，而mtDNA直接暴露于氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的高反應性氧中，缺乏組蛋白及其他結(jié)合蛋白的保護，缺乏完善的損傷修復系統(tǒng)，致使氧化損傷成為mtDNA突變的主要原因，所以mtDNA比核DNA突變率高5～17倍。
1自由基的產(chǎn)生
自由基(free radical)是具有一個不配對電子的原子和原子團的總稱。引起人體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生的原因很多。一方面，由紫外線和射線的照射、臭氧、大量體育運動、藥物、酒精、吸煙等外來因素引發(fā)的自由基稱為“外源性自由基”；另一方面，在新陳代謝過程中由人體內(nèi)生化反應所產(chǎn)生的自由基稱為“內(nèi)源性自由基”。本文重點討論內(nèi)源性自由基產(chǎn)生的機制。
1．1自由基產(chǎn)生的線粒體機制
1971年Loschen年先發(fā)現(xiàn)線粒體呼吸鏈能產(chǎn)生氧自由基，研究表明人體90％的自由基是由線粒體產(chǎn)生的。生理狀況下，有1％～2％的氧接受一個電子生成O2，或再接受一個電子生成H2O2。線粒體呼吸鏈可能通過“滲漏機制”產(chǎn)生氧自由基，復合物Ⅰ、Ⅲ是電子漏(electronleak)產(chǎn)生的主要部位，“漏出”的電子直接和氧結(jié)合形成超氧自由基。
1．2黃嘌呤氧化酶途徑
缺血、休克等病理條件下黃嘌呤脫氫酶(xanthinedehydrogenase，XD)大量轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤氧化酶(xanthine ocidase，XO)。降解ATP依次為ADP、AMP和次黃嘌呤，再轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩幔磻薪M織內(nèi)O2-、OH·等氧自由基大量增加。
1．3花生四烯酸(AA)途徑
缺血再灌注時，由于細胞內(nèi)Ca2+超載，激活了鈣依賴的磷脂酶，引發(fā)花生四烯酸(AA)代謝。通過環(huán)氧合酶和脂氧合酶的作用產(chǎn)生大量的OH·和H2O2。
1．4 NO合成酶(NOS)途徑
NO是活性氮的前體，在血管內(nèi)皮細胞、血小板、巨噬細胞和神經(jīng)細胞等許多細胞中，由NO合成酶催化合成。過量的NO與氧迅速反應生成NO-、NO2、NO3-等。這些是強效氧化劑，能自由彌散通過胞膜，抑制細胞線粒體呼吸，減少ATP生成，引起組織損害。
另外炎癥反應引起的中性粒細胞激活，殺滅病原微生物同時可形成大量氧自由基；各種應激反應導致兒茶酚胺增加，產(chǎn)生具有細胞毒性的氧自由基。
2自由基引起mtDNA損傷的實質(zhì)
自由基對DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類等生物分子發(fā)生攻擊的過程中，主要發(fā)生氫抽提反應、電子轉(zhuǎn)移反應、加成反應、終止反應及歧化反應等5種基本的自由基反應。
2．1羥自由基
攻擊堿基時，主要是·OH加成于富含電子的DNA雙鏈，尤其在嘌呤N-7-C-8位點和嘧啶5、6-位點上；攻擊糖基時，脫氧核糖鏈上一核糖被提取氫，導致鏈斷裂，堿基逸失。這些堿基、糖基的改變可導致mtDNA點突變、缺失和插入突變，其中以片段缺失多見。
2．2氮氧自由基ONOO-
氮氧自由基可與H2O2形成1-O2，使DNA脫氨基生成黃嘌呤、次黃嘌呤，形成A-T、G-C的堿基突變，還可以增強線粒體氧化應激，及細胞對過氧化物介導損傷的敏感性。
2．3單線態(tài)氧
Cl-與H2O2反應生成OCl-，再與H2O2生成單線態(tài)氧，氧化DNA的鳥嘌呤。
2．4脂性自由基
據(jù)推測脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的LO·LOO·等自由基可以發(fā)揮與羥自由基相似的DNA攻擊作用。
在生理情況下由于細胞內(nèi)存有超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glrtathione peroxidase，GSH-PX)等抗氧化酶類可以及時清除自由基，保護機體。在病理條件下，由于活性氧產(chǎn)生的過多或抗氧化酶類活性下降，則可引發(fā)以上所述鏈式過氧化反應損傷線粒體DNA，進而導致各種線粒體DNA的損傷突變。
3線粒體DNA損傷的生物學標記
自由基在攻擊線粒體DNA的生化反應中，常常在線粒體DNA雙環(huán)結(jié)構(gòu)中留下?lián)p傷的痕跡即損傷的生物學標記。在對線粒體DNA損傷研究中，尋找氧化損傷的生物標志物非常重要，例如反映mtDNA鏈斷裂、8羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG)的測定；反映DNA修復與代謝酶多態(tài)性指標谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTS)及乙酰化酶(NATS)等的測定；近期研究表明，5羥甲基尿嘧啶也可以作為人類氧化應激的生物標志物。目前8-OH dG是更常用可靠的mtDNA損傷的生物標志物。
4線粒體DNA損傷的修復機制
過去多數(shù)學者認為mtDNA缺乏修復機制。近年來研究發(fā)現(xiàn)線粒體還是具有一定的DNA氧化損傷修復能力，但是這種機制并不完善。修復效率不如核DNA。
總之，線粒體中雖然存在某些DNA修復酶以防止突變發(fā)生，但缺乏校正閱讀功能且清除突變堿基的能力較低，結(jié)果使突變率增高，大約是核基因突變的10～17倍。
5線粒體DNA損傷的種類
線粒體DNA病理損傷導致的mtDNA突變主要分為以下3類：在編碼序列或tRNA、rRNA基因中發(fā)生點突變；mtDNA大段缺失，即丟失了一個以上的基因，如編碼序列、tRNA序列的缺失；線粒體DNA丟失。
5．1線粒體DNA點突變
5．1．1編碼蛋白基因的點突變是一種酶的生物缺陷
Leber氏遺傳性視神經(jīng)病是mtDNA11778位點的G-A突變，使ND4亞單位的精氨酸轉(zhuǎn)變成為組氨酸，導致復合體Ⅰ功能減退。
5．1．2 tRNA的點突變
常見位于線粒體的tRNA-Leu（UUR）基因上3243位點的A突變成G，該突變可阻礙mtDNA編碼的蛋白合成，并可嚴重導致rRNA轉(zhuǎn)錄終止，常見于線粒體神經(jīng)肌肉性疾病，如線粒體肌病、線粒體性腦病、乳酸中毒、中風樣發(fā)作綜合征(MELAS)。
5．1．3線粒體核糖體RNA基因的突變
線粒體rRNA基因的12 SrRNA基因上第1555位A到G的突變，影響蛋白質(zhì)的翻譯，導致了母系遺傳的氨基甙類誘導的耳聾和家族性耳聾。
5．2缺失突變
缺失突變不僅見于線粒體疾病，還可見于正常衰老組織。由于mtDNA特殊的結(jié)構(gòu)特點，缺失可影響細胞的能量代謝。據(jù)病理分類主要有2類缺失。
5．2．1單個缺失
缺失的分子數(shù)量常占總mtDNA的20％～80％，常見于慢性進行性外眼肌麻痹(COEP)，Kearns Sayre綜合征(KSS)及Pearson’s綜合征。
5．2．2多重缺失
常見于組織的正常衰老過程，如骨骼肌、心肌及腦。通常有以下2種：
①mtDNA4977缺失是正常衰老組織中積累常見的缺失，缺失位點為8483bp～13459bp，位于編碼ATPase8和ND5基因之間。在神經(jīng)和肌肉組織中mtDNA-4977缺失水平更高。
②mtDNA7436缺失位點為8649bp～16084bp，編碼復合體Ⅰ的5個亞單位，復合體Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的各一個亞單位，也是常見的一種缺失。
5．3線粒體DNA丟失
一些非致命性呼吸衰竭、肝功能衰竭、腎功能衰竭以及乳酸酸中毒病人的組織細胞中常見線粒體DNA丟失，造成線粒體形態(tài)學改變、細胞生長抑制。
6線粒體DNA損傷的結(jié)果
由于線粒體呼吸鏈功能在細胞基本新陳代謝中的重要作用，編碼線粒體呼吸鏈復合物的mtDNA發(fā)生氧化損傷，突變mtDNA數(shù)量超過一定閾值，其結(jié)果必將導致DNA表達異常、細胞的能量危機。
6．1由于mtDNA中各基因排列緊密，除mtDNA的D環(huán)一小段區(qū)域外，其他序列無內(nèi)含子，且部分區(qū)域出現(xiàn)基因的重疊，因此，mtDNA的任何突變都會累及基因組中的一個重要功能區(qū)域。研究表明線粒體DNA損傷后呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅳ活性顯著下降，氧化磷酸化功能受損，ATP合成減少。突變導致構(gòu)成線粒體的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)運輸機制及離子通道有缺陷，就會產(chǎn)生“代謝性疾病”。
6．2線粒體可啟動細胞凋亡的發(fā)生，在凋亡級聯(lián)反應的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著十分重要的作用。病理條件下線粒體生成大量自由基，線粒體DNA廣泛突變，線粒體電子傳遞中斷、能量生成障礙均可誘發(fā)細胞凋亡。對線粒體腦、肌病的研究表明，mtDNA缺失>40％或tRNA點突變>70％時可在肌纖維觀察到凋亡。證明線粒體DNA突變致呼吸鏈功能障礙可能是凋亡發(fā)生的病理基礎。
6．3缺失突變常使mtDNA片段游離于胞質(zhì)中，如不被代謝，游離的mtDNA片段穿過核孔，穩(wěn)定地整合到核基因組中，其過程與病毒DNA插入哺乳類細胞染色體DNA相似。有研究已經(jīng)在人胚胎、白細胞、幾種人細胞系的基因組DNA中檢出mtDNA片斷，發(fā)現(xiàn)HelaTG細胞中c-myc原癌基因有編碼細胞色素c氧化酶亞單位Ⅲ基因序列。這種插入常引起核基因的異常表達、癌基因活化和抑癌基因滅活而誘發(fā)腫瘤。如果這種插入激活了核基因的衰老相關基因，會啟動細胞的衰老進程。
7針對線粒體DNA損傷的保護措施及治療
由于對線粒體疾病的致病機制還缺乏完善的了解，現(xiàn)在還沒有有效的針對性治療措施。目前常用的一般治療措施是增加膜穩(wěn)定性，增加呼吸鏈酶活性，如輔酶Q10；自由基清除劑，如：VC、VE、谷胱甘肽；中藥治療，如：五子衍宗丸。
7．2特殊治療
研究證實150多種疾病與mtDNA損傷、突變有關。Sherratt等認為線粒體病的治療可以從3個方面進行代謝治療、成肌細胞互補、基因治療。
綜上所述，線粒體DNA有其獨特的結(jié)構(gòu)和功能特點，在維持細胞能量代謝中起著重要作用。隨著對mtDNA研究的進展，人們發(fā)現(xiàn)mtDNA損傷與線粒體腦病、肌病、代謝性疾病、糖尿病、衰老退行性疾病、腫瘤等有著廣泛的聯(lián)系，是這些疾病的分子生物學基礎。從1988年初次發(fā)現(xiàn)mtDNA病理突變至今，人們在這一領域的研究不足20年，對其確切機制仍然了解不夠，更缺乏安全有效的治療手段。因此針對線粒體DNA損傷的研究有著十分重要的意義。對不同線粒體DNA病理突變致病的分子生物學機制的研究及其針對性的預防和基因治療措施將是未來研究的主攻方向。