張震宇劉偉楊衛良畢鄭鋼
哈爾濱醫科大學附屬第一醫院骨科
摘要：
目的：
研究缺血性損傷和缺血再灌注損傷的發生情況和病理改變，探討細胞凋亡及相關基因p53、p21、Bax、Bcl-2的表達規律。
方法：
建立大鼠后肢缺血和缺血再灌注實驗模型，光鏡下觀察缺血和缺血再灌注早期的骨骼肌組織病理學變化，檢測缺血和缺血再灌注過程中細胞凋亡現象的發生及相關基因p53、p21、Bax、Bcl-2的表達。
結果：
缺血5h的大鼠骨骼肌全部存活，而缺血9h者未獲存活。缺血和缺血再灌注損傷引起骨骼肌細胞水腫、壞死和細胞凋亡，并于再灌注過程觀察到微循環障礙和中性粒細胞趨化浸潤現象。缺血7h細胞凋亡率更高，相關基因p53、p21、Bax表達與缺血時間成正比，而Bcl-2表達與缺血時間成反比。
結論：
細胞凋亡是缺血和缺血再灌注損傷的重要病理學改變。
微循環障礙和中性粒細胞趨化浸潤是缺血再灌注損傷的重要原因之一。
相關基因表達與凋亡的發生關系密切。
肌肉組織缺血再灌注損傷是近年研究的熱點之一，但多集中在心肌等平滑肌的研究，對骨骼肌的研究較少。本研究試圖通過對骨骼肌不同缺血時段缺血再灌注損傷后細胞凋亡指數及相關基因表達的監測，探討骨骼肌缺血再灌注損傷后基因調控的規律及其生物學意義。
材料與方法
一、實驗動物和分組
健康Wistar大鼠40只[由哈爾濱醫科大學第一附屬醫院動物飼養中心提供，許可證號：SYXK(黑)2006-023]，體質量250～300s，雌雄不限，清潔級。隨機取其中8只為實驗對照組，另32只，隨機分為4組，每組8只，做缺血再灌注動物實驗模型，根據缺血時間3h、5h、7h、9h分別稱為3h組、5h組、7h組、9h組，各組再灌注時間均為3h。
二、試劑
細胞凋亡試劑盒、小鼠抗p21、p53，Bax、Bcl-2蛋白抗體、SABC試劑盒均購白武漢博士德公司。
三、大鼠缺血再灌注模型建立方法
根據Gaines等的方法改進，大鼠以體積百分比為0．5％的戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉。于股骨中段水平切斷所有股部肌肉至股骨，保留股動靜脈、股神經及坐骨神經。實驗組于室溫(20℃左右)以微血管夾夾閉股動靜脈，每1h變換夾閉部位，達到預期缺血時間后，放松微血管夾，形成再灌注，灌注3h，縫合肌肉及皮膚。對照組不夾閉股動靜脈，僅離斷肌肉，取材后原位縫合肌肉。術后大鼠單獨飼養。
四、組織取材方法
實驗組大鼠，缺血3、5、7、9h再灌注3h后各時間點分別取材，取大鼠小腿后群肌0．5cm×0．5cm×0．5cm大小肌肉組織。
對照組離斷肌肉組織后當時及其后3、5、7、9h分別取材，取大鼠小腿后群肌0．5cm×0．5cm×0．5cm大小肌肉組織。
標本采用手術后切除的石蠟包埋組織。4μm連續切片，分別用于HE染色和免疫組化染色。
五、術中術后大體觀察指標
缺血模型建立后觀察皮膚顏色、肌肉斷端滲血、末梢血液循環，以判斷是否實現缺血。
缺血再灌注模型建立后，觀察皮膚顏色、肌肉斷端滲血、末梢血運、動脈搏動、靜脈回流和充盈，以判斷去除微血管夾后的血運恢復情況。
術后觀察后肢的皮膚顏色、末梢血液循環，以判斷成活情況。
六、檢測方法
取缺血3、5、7、9h再灌注3h后各時間點的骨骼肌組織，檢測骨骼肌組織細胞凋亡情況和p53、p21、Bax、Bcl-2的表達。
1．細胞凋亡的檢測：
采用武漢博士德公司的細胞凋亡檢測試劑盒。應用原位DNA斷裂位點的3’-基末端標記法(TUNEL法)，DAB顯色，之后用蘇木素液輕度復染，脫水，二甲苯透明，封固切片。
2．p53、p21、Bak、Bcl-2的檢測：
4μm厚切片，60℃烤片3h，SABC法免疫組化染色技術，之后用蘇木素液輕度復染，脫水，二甲苯透明，封固切片。
七、統計學分析
所有數據采用SPSS11．0統計學軟件處理，計量資料采用x±s表達，相關基因比較采用配對t檢驗，凋亡率比較采用X2檢驗，P＜0．05認為差異有統計學意義。
結果
一、術中、術后的大體觀察結果
缺血5h以內的骨骼肌全部成活，末梢痛覺保存較好；缺血7h的8只大鼠中4只后肢漸變為紫黑色，終壞死，4只大鼠后肢存活，但末梢痛覺不良；所有缺血9h的肢體，皮膚終漸變為紫黑色，無存活，解剖股動靜脈主干無明顯血栓形成。
二、組織學觀察結果
再灌注3h內，連續觀察HE染色組織玻片，可見明顯的缺血再灌注損傷出現。以缺血3h再灌注3h，近60％的肌細胞出現空泡，大量中性粒細胞浸潤到血管外，肌膜周邊可見浸潤的中性粒細胞。缺血3h與5h的肌組織缺血再灌注后病理變化規律相似，損傷明顯，而缺血7h和缺血9h的肌組織再灌注后病理變化雖有相似，但程度較弱，肌細胞水腫加重程度較輕，空泡形成數量和中性粒細胞貼壁浸潤數量也較少(圖1，2)。
三、細胞凋亡及p53、p21、Bax、Bcl-2的表達
正常骨骼肌和缺血3h以內未檢測到凋亡細胞，缺血5h再灌注3h，凋亡率顯著升高(X2=3．861，P＜0．01)，缺血7h再灌注3h達到高峰，凋亡率隨再灌注時間延長而升高，升高幅度較小。凋亡率、p53、p21、Bax的表達，缺血3h組與5h組相比顯著升高，差異有統計學意義(q分別為3．873、3．867、3．914、3．933，P＜0．01)；缺血5h組與7h組相比顯著升高，差異有統計學意義(q分別為3．923、3．871、3．848、3．972，P＜0．01)。Bcl-2的表達隨著時間的延長，明顯下降。各時間點凋亡率及p53、p21，Bax、Bcl-2的表達見表1(圖3～7)。
討論
隨著分子生物學的發展，細胞凋亡的分子機制得到了一定的闡明，先后發現caspase、Bcl-2、p53等很多基因都與細胞凋亡有著重要關系，同時也發現了多種引導細胞凋亡的信號引導途徑。對肌組織缺血再灌注后細胞凋亡的研究多集中在平滑肌上，對骨骼肌研究報道較少。
有研究表明，再灌注早期骨骼肌細胞凋亡率明顯升高。骨骼肌的再灌注過程中，從3～9h時都造成了p53和p21 WAF-1的累積增加。許多研究已經證明，活化的多形核白細胞(中性粒)和氧自由基在缺血再灌注過程中的骨骼肌損傷起著重要的作用。再灌注過程中產生的氧自由基能造成DNA損害，激發由p53和p21 WAF-1介導的一系列細胞反應。p53的增長程度與細胞對DNA損害的反應直接相關，可以通過p21WAF-1下游因子的增量調節來影響細胞周期停滯和凋亡。一般情況下，細胞周期停滯是由p21WAF-1的活化來誘導的。從3h到9h，Bcl-2的表達逐漸下降，當p53和p21WAF-1的表達至高時Bcl-2的表達降到至低。線粒體損傷也可能是缺血再灌注誘導細胞凋亡的重要因素。Bcl-2主要分布于線粒體膜上，組成線粒體膜的孔和道，對于維持線粒體的正常功能、控制凋亡因子的外溢有著非常重要的意義。
缺血3～5h，Bax蛋白的水平和細胞的凋亡率有所增加，但增幅較小。雖然再灌注后p53和p21WAF-1的表達率逐漸升高，但缺血3h組的p53表達率高于p2lWAF-1的表達率。這個結果可能說明p53可活化p21 WAF-1，并導致細胞周期停滯，凋亡是由Bax蛋白的活化來誘導的。我們認為，缺血3～5h由p53和P21WAF-1累積來誘導的生長抑制是提供時間以修復損傷的DNA。此時Bcl-2的表達還維持在一個較高的水平。表明Bcl-2蛋白可抑制p53誘導的細胞凋亡。Bcl-2還可通過：
①抑制鈣離子的釋放；
②抗氧化劑作用；
③保持線粒體膜的穩定性，抑制細胞色素c和凋亡誘導因子的釋放。此時Bcl-2/Bax是1．3：1．0。
缺血7h，p53和p21 WAF-1仍在累積，在開始增長時間和高峰時間方面；p21 WAF-1和Bax的變化與p53類似。Bcl-2的表達下降到較低水平，說明p53活化了Bax蛋白。細胞凋亡被誘導產生了，此時凋亡率更高。此時Bcl-2/Bax是0．6：1．0。Bcl-2/Bax的比例是決定細胞生死存亡的變阻器，當細胞接受某些刺激信號后，如果Bcl-2過表達，形成Bcl-2/Bax異二聚體增加，細胞免于凋亡；如果Bax高表達，形成Bax/Bax同二聚體增加，細胞發生凋亡。
本研究中p53與p21 WAF-1各時間點表達接近，說明p21 WAF-1可以以一種非p53誘導的方式活化，p21 WAF-1的活化和細胞凋亡可以同時發生，暗示p21 WAF-1與細胞周期停滯和細胞凋亡都有關。Didenko等指出低水平的DNA損傷產生了一個生長停止信號：p21 WAF-1使之修復損害，高水平的損害觸發了細胞凋亡反應，即使在那些已經誘導活化p21WAF-1的細胞里也發生了細胞凋亡。
組織病理學研究顯示7h后的損傷遠比3h時嚴重，DNA損害也類似。9hp53、p21 WAF-1和Bax的表達率達到至高；Bcl-2表達率至低，凋亡率無明顯增高。這說明7h時，DNA已經損害，而且是不可逆的損害，缺血7h前的藥物及手術是有效的，7h后藥物和手術可能就無能為力了。對于缺血再灌注損傷更應注重早期診斷和早期治療。
本研究結果顯示大鼠肢體缺血再灌注隨著細胞凋亡的增加，p53、p21、Bax的表達明顯上升，Bcl-2的表達明顯下降，且都在7h時達到至大，說明p53、p21、Bax、Bcl-2的表達變化與細胞凋亡、缺血再灌注損傷密切相關，提示針對這些分子的特異治療有可能在某種程度上影響缺血再灌注的進程，這種治療應在缺血7h內進行。而p53、p21、Bax、Bcl-2的檢測亦有可能作為早期肢體缺血再灌注的參考指標。