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《福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》2006年03期
【作者單位】：福建醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系
摘要：
目的：
探討肌營養(yǎng)不良癥(DMD)受累肌肉中細(xì)胞凋亡的表達(dá)及其與病變程度的關(guān)系。
方法：
5例無皮膚肌肉病變的外科手術(shù)患者(對(duì)照組)和30例DMD患者(DMD組)，局部取骨骼肌標(biāo)本行活組織檢查，應(yīng)用TUNEL原位末端標(biāo)記法及免疫組織化學(xué)法檢測細(xì)胞凋亡及Caspase3表達(dá)情況。
結(jié)果：
DMD組TUNEL及Caspase3陽性率分別為76.67%和86.67%，陽性細(xì)胞主要分布在壞死或萎縮肌纖維中，對(duì)照組呈陰性表達(dá)。陽性率與病程長短有關(guān)(r=0.437，P<0.05)，與年齡無關(guān)(r=-0.273，P>0.05)。凋亡指數(shù)與Caspase3表達(dá)呈正相關(guān)(r＝0.536，P<0.05)。
結(jié)論：
人類肌營養(yǎng)不良癥骨骼肌細(xì)胞凋亡與肌纖維萎縮、壞死有一定關(guān)系。
關(guān)鍵詞：肌營養(yǎng)不良；肌萎縮；凋亡；Caspase3
進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥(DMD)是一組骨骼肌呈進(jìn)行性消耗和肌力減弱的遺傳性疾病，直接累及肌纖維，多數(shù)患者在20歲以內(nèi)死亡，另一些患者雖然存活，但逐漸喪失生活能力。肌纖維退變、壞死和再生是DMD共同的病理特征，近年來細(xì)胞凋亡與骨骼肌發(fā)育及退變之間的關(guān)系日益引起重視。有研究顯示，在失神經(jīng)支配及皮肌炎等疾病中，細(xì)胞凋亡在肌肉損傷過程中發(fā)揮作用，但與DMD的關(guān)系尚未闡明。半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶(Caspase)是一類位點(diǎn)特異性蛋白水解酶，在細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用，處于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中心位置。其中Caspase3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶，也是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子和重要的凋亡執(zhí)行者，在凋亡的執(zhí)行階段，負(fù)責(zé)全部或部分關(guān)鍵性蛋白酶切，使之激活或滅活，其水解底物多是細(xì)胞中的功能蛋白質(zhì)，分別參與DNA修復(fù)、mRNA降解、固醇生物合成和細(xì)胞骨架重建等。筆者選取5例正常肌肉及30例DMD采用TUNEL方法及免疫組織化學(xué)法進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測及Caspase3表達(dá)情況的研究，以探討肌纖維萎縮、壞死與DMD的關(guān)系。
1材料與方法
1.1對(duì)象
1990～2003年福建醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系確診為DMD的存檔標(biāo)本30例，男性25例，女性5例，年齡(18.22±13.79)歲(4～50歲)，病程(5.15±4.65)年(1～20年)，其中終末期3例。對(duì)照組系無皮膚肌肉病變的外科手術(shù)患者5例，男性3例，女性2例，年齡（35.2±19.13)歲(16～57歲），其中4例為骨折患者，1例為食道癌患者。
1.2主要試劑
原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)，鼠抗人Caspase3(美國NeoMarkers公司)
1.3方法
所有蠟塊重新制成4μm厚切片，常規(guī)脫蠟脫水，進(jìn)行TUNEL及Caspase3染色，陽性對(duì)照由試劑盒提供，陰性對(duì)照由PBS代替一抗，按說明書操作。
1.4結(jié)果判斷
1.4.1 TUNEL法檢測肌纖維凋亡
選每張陽性切片中凋亡小體數(shù)更多的高倍視野10個(gè)，計(jì)數(shù)細(xì)胞和凋亡小體數(shù)，取10個(gè)視野的平均值為凋亡指數(shù)(AI)。AI<5%為(-)，≥5%～10％為(+)，11%～15％為(++)，>15%為(+++)。
1.4.2免疫組織化學(xué)法檢測Caspase3
陽性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色，根據(jù)細(xì)胞著色深度、范圍進(jìn)行半定量檢測，高倍鏡下選擇10個(gè)視野計(jì)數(shù)，Caspase3陽性細(xì)胞數(shù)占肌纖維細(xì)胞數(shù)<10%為(-)，10%～25%為(+)，26%～50%為(++)，>51%為(+++)。
1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
所有數(shù)據(jù)在SPSS 10.0軟件包中進(jìn)行Fisher準(zhǔn)確概率法及相關(guān)分析。
2結(jié)果
大多數(shù)DMD病例中肌纖維大小不一，各肌束均可見輕、中度圓形萎縮肌纖維及肥大纖維散在分布，可見灶性肌溶解壞死、吞噬反應(yīng)及不透明纖維，間質(zhì)纖維脂肪組織輕度增生。終末期病例的間質(zhì)纖維結(jié)締組織、脂肪組織大量增生。對(duì)照組正常肌組織TUNEL呈陰性反應(yīng)，DMD中TUNEL陽性率76.67％(23/30)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陽性細(xì)胞核著色為深棕色，細(xì)胞核大小異常，或大于正常2倍以上，或小于1/2，細(xì)胞核外形異常，常為扇貝狀、波浪狀，主要分布在壞死或萎縮肌纖維中(圖1)。DMD中7例(-)，其中3例為終末期患者；1例(+)，4例(++)，18例(+++)。Caspase3在正常肌組織中呈陰性表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)不著色；DMD陽性率86.67％(26/30)，陽性細(xì)胞著色為深棕色，主要分布在壞死或萎縮肌纖維中，陽性率與病程長短有關(guān)(r=0.437，P<0.05)，而與年齡無關(guān)(r=-0.273，P>0.05)。凋亡細(xì)胞及Caspase3在DMD中表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.536，P<0.05)。
A：對(duì)照組肌組織未見陽性表達(dá)；B：DMD肌纖維可見凋亡小體(↑)
圖1正常肌組織和DMD肌組織肌纖維凋亡(TUNEL染色×400)
3討論
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在基因調(diào)控下的主動(dòng)性死亡，具有獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)特征，與細(xì)胞壞死明顯不同，其對(duì)保證個(gè)體正常發(fā)育成熟，維持機(jī)體正常生理功能和自身穩(wěn)定，參與腫瘤形成，對(duì)于許多疾病的發(fā)生有重要的生物學(xué)意義。秦瑞峰等在肌細(xì)胞的分化、發(fā)育過程中觀察到凋亡現(xiàn)象的存在，因此認(rèn)為凋亡的研究對(duì)于認(rèn)識(shí)肌肉系統(tǒng)疾病有重要的意義。
DMD是一組骨骼肌呈進(jìn)行性消耗和肌力減弱的遺傳性疾病，直接累及肌纖維，多數(shù)患者在20歲以內(nèi)死亡，另一些患者雖然存活，但逐漸喪失生活能力。目前確認(rèn)肌纖維退變、壞死和再生是DMD共同的病理特征，但對(duì)壞死是如何啟動(dòng)的知之甚少。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物在胚胎骨骼肌生長的早期階段40％以上肌細(xì)胞通過凋亡方式清除，體外肌細(xì)胞培養(yǎng)證實(shí)分化成熟的肌細(xì)胞存在凋亡，在肌病發(fā)展過程中通過調(diào)節(jié)肌母細(xì)胞增殖和分化通道可導(dǎo)致凋亡的發(fā)生，表明細(xì)胞凋亡與肌病病變發(fā)展有一定關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，成年肌營養(yǎng)不良小鼠變化壞死的肌纖維因凋亡所致，推斷在人類肌營養(yǎng)不良癥肌纖維壞死中凋亡可能起一定作用。
筆者在顯微鏡下觀察到，DMD中受累肌纖維壞死后可見巨噬細(xì)胞浸潤及吞噬反應(yīng)，罕見有其他炎癥細(xì)胞浸潤，這與凋亡發(fā)生后無炎癥反應(yīng)的形態(tài)學(xué)改變一致。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示凋亡細(xì)胞主要出現(xiàn)在DMD壞死和萎縮的肌纖維中(占76.67％)，明顯高于正常肌組織(P<0.05)，提示人類DMD肌纖維萎縮、壞死與凋亡的關(guān)系密切。劉曉蓉等研究表明，凋亡細(xì)胞隨著mdx鼠齡的增長而增加，推斷DMD的疾病進(jìn)展可能與肌細(xì)胞的凋亡的增加有重要關(guān)系，而筆者的研究資料顯示3例終末期的DMD中未見明顯的凋亡小體，可能因?yàn)榧膊〗K末期大部分肌纖維已經(jīng)萎縮消失而被纖維脂肪組織取代，形成的凋亡小體于一定時(shí)間后大部分被巨噬細(xì)胞或鄰近的實(shí)質(zhì)細(xì)胞吞噬、降解有關(guān)。在非終末期的DMD中，其病程長短與AI值未能發(fā)現(xiàn)有一定的相關(guān)性，而且由于觀察的病例不足以進(jìn)一步分組，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有待后續(xù)研究。
Caspase是細(xì)胞凋亡的核心環(huán)節(jié)，其級(jí)聯(lián)式激活并溶解蛋白質(zhì)，決定了凋亡形態(tài)的變化。Caspase3是一種促凋亡因子，是Caspase系統(tǒng)引起細(xì)胞凋亡的下游成分，是細(xì)胞凋亡的效應(yīng)分子。Caspase3通過破壞細(xì)胞核纖層，直接導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。有資料表明Caspase3的活化在缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，但Tews等的研究結(jié)果正相反，在神經(jīng)源性肌萎縮中未見Caspase3表達(dá)。本組資料顯示，在DMD中Caspase3陽性率為86.67％，主要分布在壞死和萎縮的纖維中，正常骨骼肌呈陰性表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)在DMD中肌纖維的萎縮、壞死等改變與凋亡有關(guān)，并且存在著Caspase3的激活；資料還顯示Caspase3陽性率與病程長短呈正相關(guān)而與年齡無關(guān)，提示Caspase3的激活在DMD的肌肉損害中發(fā)揮作用。