周錦琳田野
《北京體育大學學報》2005年09期
【作者單位】：北京體育大學
國家體育總局體育科學研究所
【摘要】：
研究表明，運動引起胞漿Ca2+聚積是骨骼肌疲勞的重要原因。從研究酸性刺激時胞漿Ca2+的變化入手，從細胞水平分析急性運動可能對骨骼肌胞漿鈣穩態的影響，試圖為全面了解運動性疲勞的產生機制提供理論依據。實驗中以Fluo-3-AM為Ca2+熒光指示劑，通過激光掃描共聚焦顯微鏡系統對用體外組織分離和培養的方法獲得的單個的骨骼肌細胞胞漿Ca2+的熒光強度及其動態變化進行觀察。
結果發現：骨骼肌細胞受到酸性刺激時，胞漿Ca2+穩態被破壞。其總體變化趨勢是先略有增加后迅速減少，直至在比正常低的水平上形成新的動態平衡。鈣波的變化既有振幅的變化，也有頻率的變化。這可能提示:運動后，由于內環境酸性代謝產物的堆積，致使胞漿Ca2+穩態破壞，終引起骨骼肌疲勞。
骨骼肌疲勞一直是教練員和運動員非常關注的熱點問題之一。隨著研究的不斷深入，越來越多的研究發現胞漿鈣水平變化與骨骼肌機能之間存在著聯系。大量的研究表明，運動引起肌漿網和線粒體轉運Ca2+能力下降，胞漿Ca2+聚積是骨骼肌疲勞的重要原因。但是直至目前，有關運動后骨骼肌細胞胞漿鈣聚積的直接證據卻很少。
從細胞信號轉導的角度來看，胞漿Ca2+是細胞的第二信使。為了能夠準確地傳遞各種信息，細胞的鈣轉移系統(如細胞膜、肌漿網和線粒體鈣轉移系統等)必須時刻轉移Ca2+，把胞漿Ca2+維持在較低水平。但是，胞漿Ca2+不是一成不變的，而是處于一種動態變化中。細胞外液的各種刺激因素如PH值、溫度等變化，都可造成Ca2+細胞信號的改變。運動中，細胞外液的PH值會由于乳酸的產生而下降，pH下降又會造成骨骼肌肌漿網和線粒體攝取和釋放鈣能力的變化，從而影響到胞漿Ca2+水平。但是，以前的研究更多地集中某個時刻Ca2+的濃度變化。據此，本論文以研究酸性刺激時胞漿鈣的變化為切入點，連續觀察一段時間內胞漿Ca2+的變化，力圖系統地分析急性運動可能對骨骼肌細胞鈣穩態的影響，為全面了解運動性疲勞的產生機制提供理論依據。
1研究方法
1．1溶液的配制
1．1．1磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)
0．20 g KH2PO4，0．20 gKCl，2．90g Na2HPO4 12H2O和8．00gNaCl溶解于800mL重蒸水中，之后加水至1 000mL。再用0．1M鹽酸配制pH值為6．9的PBS溶液。
1．1．2 DMEM培養液
DMEM干粉1包(或1瓶)，Hepes．95g，青霉素(100IU/mL)66mg，鏈霉素(100μg/mL)154 mg，NaHCO3 2．2g。將上述藥品溶解于1000mL超純水或三蒸水中，調pH值至7．0。配好后除菌過濾，分裝于500mL鹽水瓶，400mL/瓶，4℃保存。
1．1．3胎牛血清
將胎牛血清在56℃40min滅活，4℃保存。使用前，將胎牛血清與DMEM培養液在無菌條件下按體積比1：10的比例混合，使胎牛血清的終止工作濃度為10％。
1．1．4 0．25％胰蛋白酶消化液(含0．02％EDTA)
胰蛋白酶(活性為1：250)2．50g，EDTA 0．20g溶解于100mL PBS溶液中，4℃冷凍24h后，濾器過濾，無菌分裝置于低溫冰箱(-20℃)保存。使用時稀釋10倍。
1．1．5 Fluo-3-AM的配制
1mg Fluo-3-AM溶解于0．805mL DMSO中，凍存。使用時取20μL Fluo-3-AM儲存液溶解于1980μLPBS溶液中，濃度10μmol/L。
1．2骨骼肌細胞的制備
出生后1～3 d的Wister大鼠3～6只(由軍事醫學科學院動物中心提供)，采用頸椎脫位方法處死動物。消毒后取出兩側腿部肌肉剪碎，0．25％胰蛋白酶液消化及分散組織塊，離心，沉淀部分加入的含有胎牛血清的DMEM培養液，吹打成細胞懸液。接種后，放入37℃CO2培養箱中進行培養。細胞接種后體外培養至第3 d后，細胞生長狀態良好，開始實驗。
1．3測試指標
骨骼肌細胞胞漿Ca2+的熒光強度及其動態變化。
1．4測試儀器
美國Bio-Rad公司生產的MRC 1024型激光掃描共聚焦顯微鏡系統。
1．5測試過程
把培養的細胞用PBS溶液漂洗3次；接著用Fluo-3-AM工作液37℃孵育30min然后再用PBS溶液漂洗3次。
把細胞培養皿置于激光共聚焦顯微鏡的載物臺上，488nm波長激光激發Fluo-3-AM發生熒光，然后在高倍油鏡下檢測。選擇合適視野后，開始掃描。每個細胞樣本均先連續掃描100～200sec測基礎熒光強度，并觀察強度穩定后，分別加入不同PH值的PBS溶液50μL，繼續掃描，動態觀察細胞內熒光強度的變化。每組觀察6個培養皿，每個培養皿觀測1～2個細胞。
1．6試劑和藥品
Fluo-3-AM、DMEM、Heres為SIGMA公司產品，胰蛋白酶為GIBCO-BRL公司生產，EDTA為美國BioRad公司生產，胎牛血清為天津市川頁生化制品有限公司生產，其余化學試劑均為國產分析純試劑或試劑。
1．7數據分析與圖象采集
數據用EXCEL軟件分析處理；圖象用Confocal Assistant 4．02和Adobe Photoshop 6．0軟件采集處理。
2實驗結果
胞漿Ca2+的熒光強度直接反映了骨骼肌細胞胞漿Ca2+的水平，其變化包括振幅和頻率的變化兩個方面。圖1為正常情況下胞漿Ca2+熒光強度的變化。從圖3可以看出，大約在30～230sec這段時間內，即細胞處于正常安靜狀態時，胞漿Ca2+熒光強度在一定的基線上波動，形成了近似于正弦波形的鈣波，振幅約為50μmol/L，頻率約為0．02 HZ(100 sec振動約2次)。
當加入pH=6．9的PBS后(圖2、圖3)，胞漿Ca2+的熒光強度總體變化的趨勢是先略有增強后迅速減弱，直至在比正常低的水平上形成新的動態平衡。鈣波振幅的變化是先快速增大(由正常時的水平增加至60μmol/L)后迅速減小(20～30μmol/L)；頻率則是先減小(0．015HZ，400sec振動約6次)再增大(0．03HZ，100SeC振動3次)。
3分析與討論
根據細胞信號轉導的理論，Ca2+是一種細胞內通訊的化學信號。胞漿Ca2+作為第二信使，在維持機體的正常生理功能方面起著非常重要的作用，幾乎一切生命現象都與Ca2+有關。細胞鈣信號的產生與終止是胞漿內Ca2+增減和波動的結果。當某種外界刺激達到細胞表面時，處于細胞膜、內質網(或肌漿網)及線粒體膜上的鈣通道開放，鈣泵的運載作用加強，使得胞外或胞內鈣庫中Ca2+釋放至胞漿中，胞漿中的Ca2+濃度增高，這就產生了鈣信號。
細胞在正常情況下即處于安靜狀態時，胞漿Ca2+水平一生所謂的鈣波。在本實驗中，胞漿Ca2+的熒光強度反映了骨骼肌細胞胞漿內Ca2+水平。從圖3可以看出，大約在30～230sec這段時間內，即骨骼肌細胞處于正常安靜狀態時，胞漿Ca2+形成了近似于正弦波形的波動，振動的周期約為50sec，振幅約為50μmol/L。以上結果說明骨骼肌細胞胞漿Ca2+在安靜時的變化符合細胞信號轉導理論的觀點，即正常狀態下的骨骼肌細胞胞漿Ca2+以鈣波的形式，周期性振蕩，始終處于動態平衡中。
運動時，肌肉是生成乳酸尤其多的部位。有報道在進行短時間至大強度靜力性運動和次至大強度動力性運動時，肌乳酸由安靜時每千克干肌重4mmol增加到94～114mmol，肌細胞內pH值由安靜時7．0的降到6．5～6．9。Byrd等在實驗中測得Ca2+-ATP酶活性下降，pH也明顯下降，肌肉中乳酸濃度增加了3～4倍。為此，本實驗中選用pH值為6．9的PBS緩沖液作為酸性刺激。
當骨骼肌細胞受到酸性(pH=6．9)刺激時，胞漿Ca2+水平出現了很明顯的變化(如圖2，圖3)，總體趨勢是先略有增加后減少，直至在比正常低的水平上形成新的動態平衡。造成這種現象的原因可能與細胞內H+的變化有關。當細胞外液H+濃度增加時，H+進入細胞內。細胞膜上的鈣泵具有Ca2+/H+交換能力，可以運進細胞內2個H+，向細胞外轉運出1個Ca2+。細胞膜上的Na+/H+交換體也可以向細胞內轉運H+。H+進入胞漿，Na+被轉運出細胞外。細胞膜上的Na+/Ca2+交換體繼而可以作用，把Na+再轉運回細胞，同時再把Ca2+排出細胞外。上述作用的結果使得胞漿內H+濃度增加，而胞內Ca2+水平下降。為了不使胞漿Ca2+水平下降，繼續維持胞漿Ca2+穩態，細胞內的鈣庫就會起作用。它們可能釋放出大量的Ca2+進入胞漿，因而造成胞漿Ca2+增多。但是當胞內Ca2+增多超過正常水平時，Ca2+釋放會通過負反饋作用而停止。細胞膜上的鈣泵和Na+/Ca2+交換體，肌漿網膜和線粒體膜上的鈣泵或Ca2+轉運體就會把細胞內多余的Ca2+轉運出胞漿，引起胞內Ca2+水平下降，在比正常低的水平上重新形成新的Ca2+穩態。
已有的大量研究通過運動后骨骼肌細胞鈣轉移系統Ca2+轉運能力下降都推測運動至疲勞時骨骼肌細胞胞漿Ca2+聚積。得出此結論的依據主要有二個方面：一是運動引起肌漿網鈣轉移系統Ca2+轉運能力下降。Pierce等發現鼠進行1次力竭性游泳后，肌漿網鈣攝取能力下降，而鈣結合能力未受影響；3次力竭后，肌漿網鈣攝取和鈣結合能力都顯著性下降。李潔發現大鼠長時間持續性跑臺運動后，紅肌和白肌肌漿網的Ca2+-ATP酶活性都下降；紅肌Ca2+轉運初始速率和至大Ca2+轉運能力也有變化。二是運動引起線粒體鈣轉移系統Ca2+轉運能力下降，線粒體鈣聚積。Duan等讓鼠進行下坡跑，結果運動后即刻肌肉內線粒體Ca2+濃度與對照組相比均有顯著性增加；48 h后，這種變化更加明顯；同時還發現未受損傷肌纖維數與線粒體Ca2+濃度值呈負相關。田野等發現大鼠90mins間歇性下坡跑運動后即刻和運動后24h與運動前相比，線粒體鈣含量分別顯著地增加；運動后48h，線粒體鈣含量開始恢復，但仍高于運動前水平。大鼠持續200mins下坡跑后24 h線粒體鈣含量非常顯著地上升，比對照組增加了81．77％。周錦琳等研究發現大強度運動后即刻大鼠骨骼肌線粒體Ca2+-ATP酶活性略有變化，但無顯著性差異；但在中等強度長時間運動后卻非常顯著地下降。把上述實驗結果概括起來就是，運動能力下降時，細胞內鈣庫——線粒體和肌漿網的鈣泵轉運Ca2+的能力下降，線粒體鈣聚積，終導致骨骼肌細胞的機能紊亂。
本研究中當骨骼肌細胞受到酸性刺激時，骨骼肌細胞胞漿Ca2+穩態受到了破壞。胞漿Ca2+經歷了一個先升高再降低，然后在比正常低的水平上重新建立穩態的過程，研究中并未發現骨骼肌細胞在受到酸性刺激后有明顯的胞漿鈣聚積現象，這與上述研究的推測結果不一致。這可能與二個因素有關：一是與運動強度、運動階段受到的刺激不同有關。上面提到的研究大多數采用大強度或中等強度長時間運動或力竭性運動，測量的大多是運動結束時或運動后恢復期Ca2+-ATP酶活性或線粒體鈣含量，由此在推測胞漿Ca2+的變化。運動強度較大，運動時間也較長，因而骨骼肌細胞中堆積的H+濃度也較高，這可能造成胞漿鈣的不可恢復性升高。二是與刺激的方式有關。本研究中采用的是體外模擬刺激的形式，在細胞外施加酸性刺激使細胞內酸濃度增加，這與運動中細胞內酸濃度增加后造成細胞外液的酸濃度增加不同。另外，本實驗刺激的程度較低(pH=6．9)，刺激的時間也比較短。細胞雖受到了酸刺激，但仍可以依靠自身調節維持胞漿Ca2+的穩態。本研究中雖未發現骨骼肌細胞胞漿有明顯的Ca2+聚積現象，但可以肯定的是當細胞外液pH值下降時，骨骼肌細胞胞漿Ca2+穩態受到了破壞。上述結果可能提示：在不同強度急性運動時，或在運動的不同階段，骨骼肌細胞內胞漿Ca2+變化可能不同。在運動的初期，肌細胞pH值下降，但由于刺激時間短，酸性作用不強，骨骼肌細胞的胞漿Ca2+水平雖然上升，但仍能通過細胞內線粒體和肌漿網等鈣轉移系統重新調節胞漿Ca2+穩態。隨著內環境酸性程度的不斷加重，鈣轉移系統的機能可能會減弱，以至于造成胞漿鈣聚積。
骨骼肌細胞內H+濃度升高，胞漿Ca2+水平下降，這也是對正常胞漿Ca2+穩態的一種破壞，它也會給運動能力帶來影響，直接的影響就是降低肌肉的張力。如果要達到某一張力，就需要比正常時更多的Ca2+，這無疑又會影響到肌漿網的功能。若此影響長期存在，那終究還是要降低骨骼肌的機能。
本研究還發現當骨骼肌細胞受到酸性刺激時，鈣波不僅只有振幅的變化，還有頻率的變化，振動頻率先減小再增大。這可能也是鈣穩態的改變的一種方式。有研究報道，鈣波頻率的變化不應是偶然的因素，它可能也有意義。在H+持續刺激的情況下，Ca2+信號如果振蕩過大會造成骨骼肌細胞的損害，頻率變化的方式減少了這種危險。如果胞漿Ca2+持續保持在較高水平，這就會造成骨骼肌細胞的的脫敏效應，以使得其它需要Ca2+表達的信息無法表達。鈣波頻率的改變也許還有減少脫敏作用的意義。若果真如此，那么在加入酸后，鈣波之后下降到低水平上更快速的振蕩的意義就十分明顯。一是可以避免胞漿Ca2+聚積對細胞造成的損害；二是可以保持細胞通過鈣信號表達的信息的正常傳遞。
按照細胞信號轉導理論的觀點，胞漿Ca2+穩態是細胞許多信息正常傳遞的基礎，細胞的鈣轉移系統會盡可能地保持胞漿Ca2+的穩定，從而維持細胞的正常機能。某一時刻胞漿Ca2+增多或減少都不能全面反映Ca2+對細胞功能的影響。因而，本研究認為，急性運動中鈣轉移系統機能下降，從而造成胞漿Ca2+穩態的破壞，骨骼肌細胞信號轉導異常可能是導致骨骼肌疲勞的原因。
4小結與建議
1)骨骼肌細胞處于正常安靜狀態時，胞漿Ca2+水平在一定的基線上波動，形成了近似于正弦波形的鈣波。骨骼肌細胞處于酸性環境中，胞漿Ca2+水平的總體變化趨勢是先略有增強后迅速減弱，直至在比正常低的水平上形成新的動態平衡。鈣波的變化既有振幅的變化，也有頻率的變化。這種變化的原因可能與胞漿內H+濃度升高有關。
2)本實驗中未發現骨骼肌細胞在酸性環境中胞漿有明顯Ca2+聚積現象，這可能與體外模擬刺激的形式有關。結果提示：在不同強度急性運動時，或在運動的不同階段，骨骼肌細胞內胞漿Ca2+變化可能不同。在運動的初期，酸性作用不強時，細胞通過線粒體和肌漿網等鈣轉移系統可以重新調節胞漿Ca2+穩態。隨著機體內環境酸性程度的不斷加重，細胞自身的這種調節作用可能會下降。胞漿Ca2+穩態的破壞可能是導致急性運動時骨骼肌疲勞的原因。
胞漿Ca2+始終處于動態變化中，如何采用更加科學合理的方法對胞漿Ca2+進行測定，仍是一個迫切需要解決的問題。