——活性氧與細胞的增殖、分化和凋亡及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
景亞武易靜高飛湯雪明
《細胞生物學雜志》2003年04期
【作者單位】：上海第二醫(yī)科大學細胞生物學教研室
上海第二醫(yī)科大學細胞生物學教研室
上海第二醫(yī)科大學細胞生物學教研室
上海第二醫(yī)科大學細胞生物學教研室
【摘要】：
活性氧(reactive oxygen species，ROS)是生物體有氧代謝產(chǎn)生的一類活性含氧化合物的總稱，主要包括O2·-、H2O2、·OH等，機體細胞通過多種途徑維持ROS產(chǎn)生與消解的動態(tài)平衡。近年的研究揭示ROS參與細胞正常的生理過程，與細胞的增殖、分化及凋亡密切相關(guān)。不同刺激誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生的內(nèi)源性ROS可作為第二信使，通過改變氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)增殖、分化和凋亡相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中多種靶分子的活性，決定細胞的命運。
細胞的增殖、分化和凋亡是真核細胞基本的生物學行為，不同的外來信號(或其組合)，通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，決定細胞走向增殖、分化或者凋亡。長期以來，活性氧(reaetive oxygen species，ROS)被認為只是一類損傷細胞的毒性物質(zhì)，近年的研究發(fā)現(xiàn)，ROS參與了對細胞增殖、分化和凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而參與了這些重要細胞活動的調(diào)控，本文就此作一綜述。
一、細胞內(nèi)活性氧的生成及其調(diào)控
1．細胞內(nèi)活性氧的生成
氧氣是多數(shù)生物體生命活動的基礎(chǔ)物質(zhì)之一，其作用是參與能量代謝，主要是參與線粒體的呼吸和氧化磷酸化，生成ATP，其終產(chǎn)物主要是水。但是，氧氣代謝過程中還可產(chǎn)生一系列中間產(chǎn)物，包括氧自由基如超氧陰離子(O2·-)，羥自由基(·OH)，以及過氧化氫(H2O2)和單線態(tài)氧(1-O2)等，這些物質(zhì)具有較強的氧化能力，統(tǒng)稱為ROS。
線粒體是多數(shù)真核細胞產(chǎn)生ROS的主要部位，在有氧呼吸過程中，大部分電子沿呼吸鏈傳遞至末端與分子氧結(jié)合生成水，但一小部分電子(2％～3％)可由呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ處漏出，使得分子氧單電子還原，生成具有較強氧化作用的超氧陰離子(O2·-)，并通過特定的化學反應(yīng)生成羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)等。實際上，大部分ROS的起初來源都是O2·-。
正常狀態(tài)下，線粒體ROS的生成速率主要受線粒體內(nèi)膜跨膜電位Δψm的控制。近來發(fā)現(xiàn)，線粒體中調(diào)節(jié)氧化磷酸化偶聯(lián)效率的解偶聯(lián)蛋白(Uncouplingprotein，UCP)可以引起跨膜H+梯度(ΔμH+)的消解而沒有任何能量的產(chǎn)生(稱為“質(zhì)子漏”)，這種溫和的解偶聯(lián)(mild uncoupling)引起的“質(zhì)子漏”可直接降低線粒體Δψm，使得ROS的生成速度降低。
結(jié)合在細胞質(zhì)膜上的酶復(fù)合體NADPH氧化酶是產(chǎn)生O2·-另一重要部位，主要由胞漿中的P47phox、p67phox和Rac1/2以及胞膜上的gp91phox和P21phox組成。起初發(fā)現(xiàn)該酶復(fù)合體存在于吞噬細胞，在外界信號(如細菌脂多糖，細胞因子TNF-α、IL-1、IFN-γ等)作用下迅速活化，產(chǎn)生大量的ROS，形成氧化爆發(fā)，以清除入侵的病原微生物。
新近有報道指出，具有NADPH/NADH氧化酶活性的酶也存在于許多非吞噬細胞中。機體多器官平滑肌均發(fā)現(xiàn)gp91phox的同源物Nox1，且在小鼠NIH3T3細胞中過表達Nox1，ROS的產(chǎn)生增多。由于NADPH氧化酶具有激活快、失活也快的特點，故認為其產(chǎn)生的ROS可能作為信使分子，在調(diào)節(jié)機體細胞增殖、分化和凋亡相關(guān)的信號傳導(dǎo)過程中具有更為重要的意義。
此外，細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及一些酶類例如，環(huán)氧合酶、脂氧合酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶以及黃嘌呤/次黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)等也可通過特定的化學反應(yīng)產(chǎn)生O2·-。
2．細胞內(nèi)活性氧的消解
(1)抗氧化酶系統(tǒng)及抗氧化小分子
參與抗氧化應(yīng)激的酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、CAT。SOD包括位于線粒體的Mn-SOD和位于胞漿的Cu/Zn-SOD，主要催化兩分子的O2·-形成—分子H2O2和一分子O2。CAT位于過氧化物酶體中，主要催化H2O2形成H2O和分子O2。
此外，一些小分子物質(zhì)如維生素A、C、E也參與清除氧自由基，防止脂質(zhì)過氧化，是機體抗氧化防御系統(tǒng)重要的一部分。
(2)巰基還原緩沖體系
還原型谷胱甘肽(GSH)是細胞內(nèi)分布更廣的非蛋白類巰基抗氧化物，通過NADPH依賴的谷胱甘肽還原酶(GR)的催化作用，細胞內(nèi)還原型GSH與氧化型GSSG保持動態(tài)平衡，并已成為表征細胞抗氧化能力的一個重要指標。
硫氧還蛋白(Trx)及其還原酶TrxR，是細胞內(nèi)抗氧化巰基還原緩沖體系的另一重要成員。Trx的催化活性部位(-Cys-Gly-Pro-Cys-)含有特征性的對氧化還原敏感的半胱氨酸-SH/S2，正常生理狀態(tài)下，還原型Trx主要位于胞漿，催化各種底物蛋白的二硫鍵還原為巰基。近期也發(fā)現(xiàn)各種刺激引起胞內(nèi)ROS增高時，Trx易位入核，并直接催化胞核中某些轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合域中半胱氨酸殘基(Cys)還原，提高其促進轉(zhuǎn)錄的活性，但其確切的轉(zhuǎn)位機制尚不清楚。
細胞內(nèi)活性氧的生成及消解見圖1。
3．細胞的氧化還原平衡
細胞的氧化還原狀態(tài)常表達為oxidation/reductionstate，或Redox state，正常情況下，機體細胞ROS的產(chǎn)生與消解處于一種動態(tài)平衡過程中，細胞內(nèi)環(huán)境氧化還原狀態(tài)相對穩(wěn)定。各種刺激(如炎癥、紫外線等)引起矛盾雙方任何一方力量的相對增強，必將引起細胞氧化還原狀態(tài)的改變，通過相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致相關(guān)基因表達水平的改變，細胞表現(xiàn)不同的生物學效應(yīng)。
二、活性氧與細胞的增殖、分化和凋亡
早期認為，ROS是細胞有氧代謝的“副產(chǎn)品(byproducts)”，其主要效應(yīng)是攻擊胞內(nèi)生物大分子，具有一定的細胞毒作用，而細胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)把這種毒性效應(yīng)限制在一定范圍之內(nèi)。近年的一系列研究表明，細胞內(nèi)ROS水平的輕微增高促進細胞的增殖和分化，而胞內(nèi)ROS水平的顯著增高則快速觸發(fā)細胞的凋亡。由此可見，細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生可能不是—種“副產(chǎn)品”，而是“目的性(purposeful)”的產(chǎn)物，在這些過程中，ROS的角色是細胞內(nèi)一類重要的信號分子。
ROS與細胞增殖的關(guān)系在10余年前開始受到關(guān)注，新近更是不斷有文獻報道。例如，在各種生長因子如EGF、PDGF、FGF等引起細胞增殖(平滑肌細胞、肝細胞、PC12細胞等)的同時，往往伴有ROS的產(chǎn)生。又如，直接給予低濃度外源性的H2O2或O2·-同樣可以引起平滑肌細胞、成纖維細胞等迅速增殖；而一定程度上干預(yù)細胞ROS的產(chǎn)生則抑制其增殖。
新近幾年ROS與細胞分化的關(guān)系亦研究較多，特別是腫瘤發(fā)生與防治的深入研究為這方面提供了的大量證據(jù)。如抗腫瘤藥物丁酸、阿霉素引起的胞內(nèi)ROS水平改變是誘導(dǎo)人類K562細胞分化為成熟紅細胞的關(guān)鍵一步；同樣NGF誘導(dǎo)鼠PC12細胞分化為神經(jīng)細胞，IL-1誘導(dǎo)胚胎干細胞分化為心肌細胞的過程中均有ROS的產(chǎn)生。
ROS與細胞凋亡的關(guān)系研究由來已久，近年來更有大量證據(jù)表明ROS參與了多種類型的細胞凋亡。例如，多種凋亡刺激因子(如TNF-α、As2O3等)都可刺激ROS水平的增高，許多ROS的消解劑如GSH、SOD等，均可在一定程度上拮抗凋亡。不少證據(jù)還支持ROS參與了凋亡誘導(dǎo)早期線粒體的變化。
三、ROS參與增殖、分化、凋亡相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
1．引起細胞內(nèi)ROS水平增高的信號
胞外多種刺激信號均以細胞內(nèi)ROS作為第二信使，調(diào)節(jié)細胞走向增殖、分化和凋亡。這些信號主要分為兩大類：化學信號和物理信號，前者包括生長因子、細胞因子和激素等，通過與膜上相應(yīng)的受體分子結(jié)合，引起細胞內(nèi)ROS水平增高，進而激活相關(guān)的信號通路，主要參與生理情況下細胞正常的增殖、分化和凋亡的調(diào)控。后者包括紫外照射、離子輻射、熱、滲透壓和機械刺激等，產(chǎn)生的外源性ROS擴散入細胞，或同時激發(fā)內(nèi)源性ROS生成，主要參與應(yīng)激情況下細胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。
2．細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
細胞中具有多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，如分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs)、Smads及JAK/STAT等，其中MAPKs家族與增殖、分化、凋亡的發(fā)生密切相關(guān)，并且是重要的氧化還原敏感的(redox-sensitive)信號通路，因此本文對其進行詳細介紹。
迄今為止發(fā)現(xiàn)的MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-Jun N端激酶位激激活的蛋白激酶(JNK/SAPK)和P38MAPK三條途徑，其共同特征是都包含三個保守的蛋白激酶成分。在胞外刺激信號的作用下，三級蛋白激酶成分順序激活(MAPKKK→MAPKK→MAPK）。至后激活轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)特定基因的表達。盡管具有相似的激活機制，但每條途徑都有其特異的上游激活劑和相應(yīng)底物，產(chǎn)生不同的生物效應(yīng)，如ERK主要接受生長因子的刺激，通過Raf→MEK→ERK通路激活轉(zhuǎn)錄因子，其中主要是活化蛋白-1(AP-1)和核因子kappa B(NF-κB)的活性，介導(dǎo)細胞增殖和分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；而JNK和P38MAPK主要感受炎癥、氧化應(yīng)激及損傷等刺激，分別通過MEKK1→MKK4/MKK7→JNK/SAPK或MEKKs/TAK→MKK6/3→P38MAPK，激活核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，進而誘導(dǎo)保護性蛋白的生成，增強細胞對應(yīng)激原的抵抗力，或介導(dǎo)細胞凋亡。新近發(fā)現(xiàn)的MAPKs家族的第四種成員，即分裂原激活的大分子蛋白激酶(BMK1/ERK5)，可能也參與調(diào)控應(yīng)激情況下細胞的反應(yīng)，但對其上游激酶及下游底物成分尚無確切的認識。
3．ROS作用的靶分子
盡管ROS參與細胞增殖、分化和凋亡相關(guān)的多條信號通路的調(diào)控，但ROS作用的確切部位尚未闡明，目前越來越多的證據(jù)顯示，ROS可能通過改變氧化還原狀態(tài)，調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中從細胞膜到細胞核不同水平多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的活性，完成其信使分子的功能。
(1)MAPKs級聯(lián)反應(yīng)
A．通過磷酸化/脫磷酸化調(diào)控
信號傳遞過程中，各級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白同時受到上游蛋白激酶和相應(yīng)的磷酸酶的雙重調(diào)節(jié)，其活性部位(主要是絲/蘇氨酸或酪氨酸殘基)可逆的磷酸化/脫磷酸化是傳遞信號的基礎(chǔ)。
MAPKKK具有絲/蘇氨酸蛋白激酶的活性，是信號傳遞過程中一類重要的激酶；相應(yīng)的，細胞內(nèi)也有一系列的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶(PPs)對抗其磷酸化作用。如PPs中的PP2A的活化抑制ERK1/2及MEK1/2的活化，PP2C的活化抑制JNK及P38MAPK的活化。繼續(xù)深入研究卻發(fā)現(xiàn)H2O2對PP2C酶的活性無明顯的抑制，卻引起P38的活化，因此是否在信號通路中存在其他氧化還原敏感的PP酶有待進一步考察。
雙特異激酶MAPKK及其上游蛋白激酶如胞膜的受體酪氨酸激酶(RTKs)和胞漿的Src家族、JAK家族等小分子都具有酪氨酸激酶(PTKs)的活性，同時細胞內(nèi)也有一系列的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)對抗PTKs的磷酸化作用。越來越多的資料提示細胞內(nèi)ROS水平增高或相對的氧化狀態(tài)可引起PTKs的活性增強，但迄今為止尚無充足的證據(jù)表明ROS直接激活RTKs和PTKs等激酶，因為用H2O2直接作用于PTKs并不能增加其酶活性，卻迅速引起PTPs的失活，予以GSH或其他巰基類還原劑后PTPs的活性恢復(fù)，而小劑量的H2O2抑制PTPs后PTK的活性增強，因此認為，ROS通過抑制PTPs的活性間接激活PTKs(圖2)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，所有PTPs的催化活性部位都含有一個保守的cys(C124)，胞外刺激信號引起的細胞內(nèi)ROS水平增高，可直接氧化或通過氧化型GSSG間接氧化cys上的-SH(cys-SH)，分別形成-SOH或-SSG，造成PTPs失活。
B．通過氧化還原敏感元件調(diào)控
ASK1是JNK和P38通路中MKK3/6、MKK4/7的上游蛋白激酶(MAPKKK)，在生理情況下，細胞漿處于相對還原的狀態(tài)，此時Trx與ASK1氨基端結(jié)合并抑制其激酶的活性。氧化應(yīng)激或TNF等引起的胞內(nèi)ROS增高，可通過兩種機制調(diào)節(jié)ASK1的活性：一方面ROS引起Trx的二聚化并與ASK1分離，另一方面ROS可直接催化ASK1的cys-SH氧化，兩分子ASK1通過分子間二硫鍵形成同源二聚體，酶的活性恢復(fù)，激活下游MAPKK，凋亡信號得以繼續(xù)傳遞。
同樣JNK的氧化激活也受到類似的調(diào)節(jié)，正常情況下，細胞內(nèi)富含cys的氧化還原敏感元件GSTp與JNK結(jié)合并抑制后者的磷酸化，紫外照射或低濃度H2O2的刺激下，GSTp寡聚化并與JNK分離，JNK的活性得到恢復(fù)。
C．通過Ca2+調(diào)控
同為第二信使，Ca2+與ROS之間的關(guān)系越來越受到人們的關(guān)注。目前大量的資料提示ROS可能通過直接影響胞內(nèi)Ca2+濃度的變化調(diào)節(jié)下游基因的激活或轉(zhuǎn)錄下調(diào)。
(2)轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原調(diào)節(jié)
轉(zhuǎn)錄因子中許多為氧化還原敏感的，即它們的活性受細胞氧還狀態(tài)的調(diào)控，這些氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子如NF-kβ、AP-1、P53等都含有保守的cys，人們猜測活性cys的巰基開關(guān)可能直接調(diào)節(jié)基因的表達。
NF-κB是很早發(fā)現(xiàn)的與細胞氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)多種蛋白的表達，參與細胞增殖、分化、凋亡、炎癥及免疫等多種生物學效應(yīng)。靜息狀態(tài)下，NF-κB由P65、P50和抑制亞基I-κB組成，定位于胞漿，在外來信號的作用下，I-κB磷酸化，并被遍在蛋白輟合酶降解，NF-κB活化入核，并與特異的DNA結(jié)合，調(diào)節(jié)其表達。研究發(fā)現(xiàn)，胞漿中抑制亞基I-κB的降解是NF-κB活化的關(guān)鍵，而入核后NF-κB與DNA的特異結(jié)合則是調(diào)節(jié)基因表達的決定性因素。胞內(nèi)ROS增高或細胞處于相對氧化的狀態(tài)，一方面通過增強遍在蛋白輟合酶的活性，促進I-κB的降解；另一方面卻通過氧化P50亞基cys抑制NF-κB與DNA的結(jié)合。如dithiothreitol預(yù)處理抑制TPA引起的NF-κB的活化，應(yīng)用谷胱甘肽還原酶抑制劑GR后，這一效應(yīng)被部分逆轉(zhuǎn)，相反在TPA處理1小時后加入dithiothreitol，NF-κB的活化效應(yīng)得到增強提示NF-κB激活過程中從胞漿易位至胞核存在氧化型向還原型的轉(zhuǎn)變，且P50亞基還原型cys62是NF-κB與DNA有效結(jié)合的重要保證，這就產(chǎn)生了一個矛盾，即轉(zhuǎn)錄因子的激活需要氧化狀態(tài)的存在而轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合則需保持還原狀態(tài)。
目前認為，Trx和GSH參與調(diào)節(jié)NF-κB在胞漿與胞核不同的氧化還原狀態(tài)，主要依據(jù)是：
(1)含有活性cys的Trx表面具有靴狀中空結(jié)構(gòu)，可特異識別NF-κB P50亞基DNA結(jié)合域的loop結(jié)構(gòu)，并作為質(zhì)子供體促進氧化型cys的還原。
(2)氧化應(yīng)激可促使Trx由胞漿易位入核。
(3)共轉(zhuǎn)染hTrx與LTR-driven報告基團，依賴于NF-κB的報告基團表達增多。
同樣，氧化應(yīng)激或胞內(nèi)GSSG增高引起轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活化，但抑制其與DNA的結(jié)合。與NF-κB不同，Trx不能直接作用于AP-1，但可通過對另—種核蛋白Ref-1的氧化還原調(diào)節(jié)增強AP-1與DNA的結(jié)合能力。其他含cys的轉(zhuǎn)錄因子如P53、腎上腺皮質(zhì)激素受體也受到類似的調(diào)節(jié)。
由HIF-1α和HIF-1β組成的異源二聚體——缺氧化還原調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1的活性取決于對氧高度敏感的HIF-1α的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，ROS對HIF-1α的調(diào)節(jié)依賴于其蛋白結(jié)構(gòu)中的ODD域，正常生理條件下產(chǎn)生的H2O2足以引起遍在蛋白酶的磷酸化和HIF-1α降解，而缺氧時這一氧化還原敏感的蛋白降解途徑被抑制，大量HIF-1α與HIF-1β結(jié)合形成穩(wěn)定的二聚體，并易位入核，調(diào)節(jié)有關(guān)基因的表達，如促紅細胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子和血管緊張素(ANG)等的表達，這在低氧條件下機體代償性的增加血供，維持細胞正常的生理功能具有重要意義。
4．胞外刺激引起的胞內(nèi)ROS產(chǎn)生部位、有關(guān)的信號通路以及相應(yīng)的生物學效應(yīng)(見表1，圖3)
四、結(jié)束語
ROS，尤其是H2O2作為細胞的信使分子，對于細胞增殖分化凋亡的調(diào)控、胚胎的正常生長發(fā)育和機體穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)具有重要意義。ROS的來源、ROS的作用機制、ROS對不同類型細胞作用的專一性以及ROS如何調(diào)節(jié)細胞的生死平衡將為近期研究的焦點，進一步的基礎(chǔ)研究也將對認識ROS的生理病理功能和指導(dǎo)臨床相關(guān)疾病的有效防治提供新的思路。