【作者】徐文靜張君陸環謝建新
【機構】石河子大學醫學院省部共建新疆地方病與民族高發病教育重點實驗室，新疆維吾爾自治區石河子832000
【刊名】《國際內分泌代謝雜志》2009年第29卷第B04期，47-50頁
【關鍵詞】內質網應激未折疊蛋白反應內質網相關性死亡
【文摘】
已知缺氧、營養物質缺乏、氧化應激、異常糖基化反應、鈣代謝紊亂等都能引起內質網應激反應，并表現為3個步驟：蛋白質合成暫停、內質網應激蛋白表達和細胞凋亡等，每一過程的分子機制現已逐步被揭示。當細胞內質網穩態遭到破壞時，細胞不能正確合成蛋白質，也不能發揮正常的生理功能，甚至會出現細胞凋亡。掌握內質網應激過程對進一步理解糖尿病、心腦組織缺血性梗死、神經退行性病變等多種疾病的發生機制有十分重要的理論意義。
真核細胞的膜蛋白及分泌性蛋白是在內質網(ER)中合成后，經過翻譯后修飾、折疊和組裝，由高爾基體進一步加工后轉運到膜上或分泌到胞外。在缺氧、氧化應激、異常糖基化反應以及鈣離子穩態失衡等各種因素作用下，新生肽鏈的修飾折疊與組裝受到干擾，將引起未折疊蛋白在ER中堆積，使細胞產生內質網應激(ERS)，并激活未折疊蛋白反應(UPR)信號轉導通路，導致細胞自身通過改變其轉錄和翻譯過程，減少蛋白的合成，降低進入內質網的蛋白量，同時上調內質網中分子伴侶和折疊蛋白的表達，增強內質網的蛋白折疊功能。細胞還可以通過上調內質網蛋白降解途徑的相關基因表達，加速未折疊蛋白的降解過程，以提高細胞在有害因素下的生存能力。
ERS是在應激條件下，為維持細胞內環境穩定，保持細胞生存，細胞啟動的自我保護反應機制。目前已證實，內質網應激時細胞至少發生3個方面的反應，現綜述如下。
1 UPR
1．1未折疊蛋白分子伴侶
真核細胞中，分泌蛋白和膜蛋白在翻譯后，內質網修飾和轉運合成的蛋白質到達正確的目標位置或細胞外區域。蛋白質的正確折疊需要內質網中蛋白質分子的參與，其中主要有3類分子伴侶：熱休克蛋白(HSP)家族的糖調節蛋白(GRP)78；外源凝集素類的鈣連接蛋白/鈣網織蛋白(CNX/CRT)；蛋白二硫化物異構酶家族中的巰基氧化還原酶。
GRP78也稱為免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)，是ERS的主要分子伴侶，也是該反應的關鍵分子。BiP由N端的ATP酶結構域和C端的待折疊蛋白結合結構域組成。生理狀態下，BiP結合于內質網膜上的感應蛋白雙鏈RNA激活蛋白激酶樣內質網激酶(PERK)、肌醇需求激酶(IRE1)和轉錄活化因子(ATF)6，使其處于未激活狀態。當未折疊蛋白與BiP結合增加時，導致BiP與感應蛋白結合減少，激活感應蛋白及其后的UPR。
1．2 UPR及其通過內質網膜的信號轉導通路
內質網中過多的未折疊蛋白將激活細胞內重要的信號轉導途徑，引發UPR。UPR可以將內質網管腔內蛋白折疊情況反饋到細胞漿和細胞核內，誘導內質網駐留蛋白和折疊相關酶的表達，增大內質網管腔來提高內質網的蛋白折疊能力；也可以通過短暫下調，甚至關閉蛋白質合成相關的轉錄和翻譯，以降低內質網蛋白質的生物合成，或者通過增強內質網蛋白降解來增加未折疊蛋白清除能力。在ERS的情況下，哺乳動物的UPR信號轉導形成了3條互相聯系的通路：跨膜蛋白IRE1/內質網核信號1(ERN1)、PERK/PEK(Pancreatic enriched kinase)、ATF6在轉錄和翻譯水平介導3條不同的信號通路。
1．2．1 PERK通路
PERK屬于真核細胞蛋白質翻譯起始復合體eIF2α蛋白激酶家族成員，是位于ER的Ⅰ型膜蛋白，N端感受ERS信號，存在非配體依賴性的二聚化結構域。非ERS時二聚化位點被BiP遮蓋，C端有絲/蘇氨酸蛋白激酶功能域。PERK活化后能夠特異性地磷酸化eIF2α51位絲氨酸，下調胞內蛋白合成的整體水平。Koumenis等觀察到，缺氧能激活PERK，磷酸化eIF2α，使小鼠胚胎成纖維細胞穩定表達PERK顯性負相關等位基因。而PERK缺失的純合子小鼠胚胎成纖維細胞在缺氧條件下，磷酸化eIF2α減弱，蛋白質合成抑制減少，與野生型細胞相比，在較長的缺氧條件下細胞存活顯著減少。而將突變的eIF2α(S51A)等位基因導入小鼠胚胎成纖維細胞后，由于eIF2α(S51A)不能被PERK磷酸化，這些細胞表現為對缺氧的敏感性增加。
1．2．2 IRE-1通路
ERS能導致IRE-1腔內結構域與BiP解離，IRE-1寡聚化，自身磷酸化激活其RNA酶活性。兩者的底物都是X-盒結合蛋白1(XBP1)mRNA，其編碼堿性含有亮氨酸鋅指結構的轉錄因子。IRE-1的RNA酶活性切割XBP1mRNA，使其成為成熟的mRNA，其編碼的XBP1蛋白能增強分子伴侶蛋白BiP的轉錄活性。分子伴侶蛋白表達上調在ERS的調節中具有重要作用，可促進ER功能恢復。
1．2．3 ATF6通路
ATF6是Ⅱ型膜蛋白，哺乳動物細胞具有兩種亞型，即ATF6α(90 ku)和ATF6β(110ku)，二者結構相似。C端位于ER腔內，具有多個BiP結合位點和兩個高爾基體定位信號(Golgi localization signal，GLS)。非ERS時，ATF6和RiP形成穩定的復合物，通過BiP對GLS的抑制作用而停留在ER上。ATF6α和ATF6β在UPR過程中通過相同的機制活化，ER腔內未折疊蛋白堆積信息能夠使BiP和ATF6分離，RiP對GLS抑制作用的解除導致ATF6轉移到高爾基體，由高爾基體蛋白酶對其跨膜片段進行切割，產生游離的50ku N端片段，該過程類似于固醇反應元件結合蛋白(SREBP)的切割活化。活化的ATF6 N端切割段可轉移到核內促進含ERS元件的轉錄因子(如XBP1)及UPR靶分子(如BiP)等基因轉錄，ATF6α和XBP1在功能上有所重疊，而ATF6β在UPR過程中并不起重要作用。此3條信號轉導通路中，PERK和ATF6通路是高等真核細胞所具有，而IRE-1通路則是在所有真核細胞中普遍存在的。
2 ERS中期整合應激反應(ISR)
蛋白質合成的暫停減輕了新生蛋白肽鏈對ER的負荷與壓力，但這種抑制過程畢竟是一種臨時性防御措施。事實上ER經較長時間應激暴露后，ERS蛋白如GRP78、GRP94以及GADD34(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 34)、CHOP(C/EBP-homologous protein，or growtharrest and DNA-damage-inducible gene 153，GADD153)、ATF4等表達增加，這樣可提高ERS細胞處理未折疊蛋白或抵御其他細胞應激的能力。磷酸化eIF2α蛋白與早期蛋白質合成暫停有關，但研究發現磷酸化eIF2α蛋白同樣與ERS中期應激蛋白的表達與蛋白質合成啟動的恢復也有關系。可見磷酸化eIF2α蛋白整合了包括ERS中期蛋白質合成中斷的恢復與應激蛋白的表達等所有后續反應，這類反應總稱為整合應激。GADD34基因是許多細胞應激因素都能調控表達的一個基因，它編碼蛋白磷酸化酶Ⅰ復合體中的一個調節亞基。實驗證明GADDM具有使磷酸化eIF2α蛋白脫磷酸，即恢復蛋白質翻譯啟動的作用。ERS時BiP/GRP78和GRP94以及ATF4，CHOP，GADD34等表達增加的機制不能用GADD34介導的蛋白質合成中斷恢復模型加以解釋。研究發現，ATF4與GADD34等mRNA在細胞漿中本身大量存在，但是ATF4與GADD34等mRNA序列5’端存在特殊的上游開放閱讀框架結構使得ATF4和GADD34通常總是處于翻譯抑制狀態。當出現ERS時，細胞漿中磷酸化eIF2α蛋白或IRE-1會激活ATF4和GADD34的mRNA上游閱讀框架結構，表達相應的蛋白質，但是激活的這些特殊結構mRNA如何在蛋白質合成普遍性抑制下進行翻譯的分子機制目前還不十分清楚。
3 ERS后期引起ER性細胞凋亡的發生
ERS細胞隨著整合應激反應的進一步演進，一方面積極調動應激反應蛋白以抵御應激誘因所造成的有害影響。同時調整ER功能以適應新的內環境變化，另一方面也會表達一些有可能導致細胞死亡的應激蛋白調節基因如CHOP等，根據情況決定清除那些根本無法恢復到正常功能狀態的ERS細胞，ERS引起細胞死亡，通過細胞凋亡作用來摧毀這些受損的細胞。ERS引起的細胞凋亡有一套自身的信號傳遞通路，稱為內質網相關性死亡(ERAD)途徑。該途徑包含ERS誘導CHOP/GADD153蛋白和JNK，是聯系ERS與細胞凋亡的重要中間信號分子。
3．1 CHOP/GADD153表達
CHOP是ERS特異的轉錄因子。其基因啟動子上具有氨基酸應答元件(amino acidresponse elemenl，AARE)，氨基酸剝奪或ERS等調節CHOP蛋白表達。CHOP蛋白或與C/EBP或與Jun/Fos家族蛋白成員形成雜二聚體，調節下游凋亡相關基因的表達。CHOP是由抗凋亡向促凋亡轉換的重要信號分子，在非應激狀態下，它的表達水平很低，而在ERS中，其表達量大大增加，PERK、ATF6、IRE-1都能誘導CHOP的轉錄。PERK通路的激活在早期通過抑制蛋白質的合成對細胞起保護作用，促進細胞的生存，隨ERS的延長，PERK通過誘導CHOP的表達促進細胞凋亡。
3．2 c-Jun氨基末端激酶(JNK)的活化
應激條件下活化的IRE-1可以結合JNK的結合器蛋白腫瘤壞死因子受體相關因子2(TRAF2)，從而激活JNK，JNK能對其底物c-Jun等轉錄因子氨基末端進行磷酸化修飾、激活這些轉錄因子和細胞凋亡信號激酶1(ASK1)，共同激活線粒體依賴的細胞凋亡過程，以調節下游基因的表達。
3．3 Caspase是執行細胞凋亡作用的終末分子
Caspase是執行細胞凋亡的水解酶。目前發現該家族共14個成員，各自作用不同，但彼此間形成級聯反應系統，其中caspase-9居該凋亡信號系統中的樞紐位置，caspase-3負責拆卸細胞，capase-12僅產生于ER，并僅在ER內活化蛋白水解。如果caspase-12酶活性升高，可從ER轉運到胞漿，在胞漿激活caspase-9和caspase-3等，之后引發細胞凋亡。通常蛋白伴侶BiP與caspase-7和caspase-12形成復合體，細胞不會表現凋亡，但是ERS時BiP減少，無法與caspase-7、caspase-12充分結合，誘發細胞凋亡。說明caspase-12暴露活化也可引起細胞凋亡。
4相關臨床疾病與展望
近年有學者報道，2型糖尿病的一個特征是胰島有淀粉樣蛋白沉積(主要是胰淀粉樣多肽)，且淀粉樣蛋白沉積與β細胞減少正相關。因此，有學者認為淀粉樣蛋白沉積引發ERS可能促進了β細胞凋亡，參與了2型糖尿病的發生。研究人類Wolfram綜合征(糖尿病-尿崩癥-視神經萎縮-神經性耳聾綜合征)發現，其糖尿病的發生與WFS1基因突變、功能缺失有關。該基因突變導致其編碼產物ER固有蛋白wolframin缺失，使ER降解錯誤，折疊蛋白質功能降低，引發持久的ERS，導致β細胞凋亡而參與糖尿病的發生。阿爾茲海默病是一種常見的神經系統疾病，病理特征是β-淀粉樣蛋白質的沉積，神經原纖維變性和神經元死亡。有研究顯示，家族阿爾茲海默病與淀粉樣蛋白質前體基因、早老因子-1(presenil-1，PS1)基因、早老因子-2基因的突變有關。PS1是主要存在于ER的跨膜蛋白質，PSI基因的突變使細胞對各種損害誘導的細胞損傷的易感性增加。關于ERS信號通路的知識還并不完善，仍需要發現已知ERS信號轉導蛋白的新底物和未知的ERS信號轉導。而且，已知一系列環境因素和遺傳因素導致的疾病會引發ERS，有利于進一步地了解多種疾病的發病機制。