《生命科學》2011年第10期
朱京譚曉榮
河南工業大學生物工程學院鄭州450001
摘要：
活性氧（reactive oxygen species，ROS）和自噬在人體內作用廣泛，且與人類的健康密切相關。兩者之間關系復雜，ROS作為誘導自噬的信號分子，參與多種誘導自噬的信號途徑，在自噬的形成過程中起著重要作用，而自噬具有減少ROS損傷的作用。對ROS與自噬之間的關系，包括ROS介導自噬的分子機制，以及ROS和自噬在腫瘤、神經退行性疾病和衰老中的作用進行綜述。
活性氧(reactive oxygen species，ROS)是一類化學性質活潑，具有較高氧化活性的分子或離子的總稱。主要包括超氧陰離子(O2·-)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(HO·）、一氧化氮（NO·)等。線粒體是ROS的主要產生部位，在線粒體呼吸過程中會有少量的電子從線粒體電子傳遞鏈復合體Ⅰ和Ⅲ中漏出，與O2結合生成ROS。此外NADPH氧化酶和過氧化物酶等也能產生ROS。過量的ROS會對蛋白質、核酸和脂質等生物大分子造成損傷，從而影響其正常生理生化功能。生物體本身存在清除ROS的體系，包括SOD酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、抗壞血酸等，這一體系使生物體內ROS保持在對機體無害的水平。
Ashford和Porter在1962年用電子顯微鏡在人肝細胞中初次觀察到自噬(autophagy)。自噬廣泛存在于真核細胞內，正常情況下細胞內的自噬處于低水平，在受到外界環境刺激時(饑餓、營養缺乏、氧脅迫等)自噬水平升高，細胞內的長壽命蛋白、可溶性蛋白、受損細胞器等胞內物質會被轉運到溶酶體進行降解，重新利用以滿足細胞所需，利于細胞存活。但當自噬水平過高時，會因過度“吞噬”胞內物而造成細胞死亡。
一般情況下，細胞內的ROS和自噬均處于正常水平，并不會對細胞造成過度損傷。但在一些不利的狀態下(如饑餓、營養缺乏、藥物刺激、劇烈的環境變化、細菌感染以及各種疾病等)，細胞內的ROS和自噬水平都會顯著升高。ROS與自噬在不利狀態下的相同反應，暗示著兩者可能存在著聯系。ROS在細胞凋亡過程中的重要作用，已被人們所肯定。研究表明，在細胞自噬過程中ROS同樣有著重要的作用。本文論述ROS與自噬的相互作用關系及其分子機制，以及ROS在細胞自噬過程中所起作用。
1自噬與ROS的關系
細胞自噬過程常常會伴隨著ROS含量的變化，能夠誘導自噬的藥物，也能導致細胞內ROS含量的改變。例如脂多糖類(LPSs)和泛半胱天冬酶抑制劑benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(Z-VAD)能夠誘導巨噬細胞產生自噬，并且會使其ROS含量升高。此外在營養缺失以及疾病過程中產生的自噬同樣伴隨著細胞內ROS水平的變化。如果用抗氧化劑降低ROS的含量，自噬水平會降低。如在癲癇持續狀態下的小鼠細胞內，自噬水平升高，產生過量ROS，施以維生素E，細胞內ROS含量降低，自噬受到部分抑制。這些情況表明ROS與自噬之間存在密切關系，主要表現在以下兩方面。
1．1自噬降低ROS毒性
正常情況下，生物體內的ROS處于較低水平，低水平的ROS在信號轉導、免疫反應以及基因的表達調控過程中起著重要作用，而ROS的過量累積則會對細胞造成毒性傷害。細胞內的蛋白質能夠被ROS氧化，喪失正常的功能并累積產生毒性。由于線粒體是ROS的主要來源，且線粒體DNA比核DNA更加脆弱，因此線粒體更易遭受ROS的攻擊而產生損傷。過量的ROS還會使線粒體發生去極化損傷，導致線粒體自噬。線粒體自噬是一個特異性的選擇過程，是細胞清除受損線粒體，維持自身穩態的重要調節機制。但線粒體自噬也有可能會促進細胞凋亡。自噬作為細胞在不利環境下的一種存活機制，可通過清除被ROS損傷的細胞器或蛋白質，降低ROS對細胞的毒性傷害，保護細胞。但有報道認為，自噬的激活也可加劇ROS的累積。另外在動物水平，如果體內固有的ROS清除系統發生異常，致使ROS累積，那么機體會補償性地提升自噬水平來降解ROS。例如，在ROS清除劑超氧化物歧化酶(SOD1)發生突變的轉基因小鼠體內，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)受到抑制，而自噬標志物Ⅱ型微管相關蛋白質1輕鏈3(LC3-Ⅱ)累積。如果自噬的產生受到抑制，會導致細胞內ROS含量的升高。例如，在自噬相關基因突變的酵母菌細胞內ROS水平會比野生型的酵母菌株的高。自噬雖然能夠抵抗ROS的毒性，但是如果細胞內的ROS水平超出自噬所能承受的范圍，即通過自噬仍不能清除過量的ROS，始終保持在較高水平，則會引起細胞過度自噬，終導致細胞死亡?？梢钥吹?，原本作為細胞存活機制存在的自噬，一旦被過度激發，反而會造成細胞死亡。這提示，生物體內的生化反應異常復雜和準確，在探索和研究中一定要謹慎。
1．2 ROS介導自噬發生
ROS可誘導自噬并在自噬過程中起重要作用，多種情況能夠引起細胞內ROS的增加，進而檢測到自噬標志物LC3-Ⅱ的累積。一些外源物質通過刺激細胞產生ROS，進而誘導自噬。例如檳榔提取物和線粒體電子傳遞鏈抑制劑等能夠引起癌細胞中ROS水平升高，誘導自噬產生；苯并惡嗪衍生物DBO通過促使胞內ROS水平升高誘導自噬；直接添加H2O2也會誘導自噬產生。另外在一些疾病中，內源性的ROS水平也會升高，引起自噬，如在壞死性小腸結腸炎疾病中，腫瘤壞死因子TNF-α可以顯著的造成線粒體功能異常，進而產生大量ROS，誘導線粒體自噬的產生。在一些神經退行性疾病，如阿爾茨海默病(AD)中，ROS在自噬的誘導過程中也起著重要作用，而腫瘤細胞中ROS也能誘導自噬產生。
2 ROS影響自噬的機制
通過前文的論述，可知ROS能夠誘導自噬的產生，作為介導自噬的信號分子，其作用機制目前仍未清楚，還需要深入研究。下面列舉了一些已經報道的相關分子機制，從中可以看到其機制的復雜（圖1)。
ROS自身可通過Beclin-1、HMGB1、p38/p53、GSK-3β、Ca來誘導自噬；
也可通過抑制Atg4、Akt/mTOR進而誘導自噬；
TIGAR間接降低ROS水平，阻礙自噬產生。
圖中用虛線標注的Ca途徑為推測的可能途徑。
(ROS：活性氧；autophagy：自噬；HMGB1：染色質相關的核蛋白
TIGAR：一種p53靶基因編碼的蛋白TP-53誘導的糖酵解和凋亡調控因子；)
圖1 ROS影響自噬的途徑
酵母自噬發生過程中，Atg4對Atg8(LC3、GATE-16的同源物)的C端進行剪切，被剪切后的Atg8與磷脂酰乙醇胺(PE)結合，然后Atg8-PE結合到自噬小體膜上，參與自噬小體的裝配，促進自噬小體的成熟。當自噬小體與溶酶體融合后，Atg4剪切Atg8-PE釋放出Atg8。RuthScherz-Shouval等報道，饑餓促使細胞產生ROS誘導自噬，在此過程中H2O2與HsAtg4A(屬Atg4家族)作用上調自噬水平。HsAtg4A是半胱氨酸蛋白酶，在其活性位點下游4個氨基酸處有一半胱氨酸殘基Cys，用絲氨酸替代Cys81后，其氧化還原敏感性降低，以GATE-16為標記的自噬小體的形成受到顯著抑制。H2O2可能作用于Cys81使得HsAtg4A部分失活，喪失剪切Atg8-PE的能力，以至于Atg8-PE在細胞內積累，促進自噬的產生。
Beclin-1(Atg6的同源物)是與人體細胞自噬形成相關的一種重要蛋白，Beclin-1和Beclin-2相互作用調控自噬水平，上調Beclin-1的表達量能夠促進自噬的產生。有研究表明Beclin-1的表達量與ROS相關，例如在癌細胞中氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoproteins)通過過氧化物酶體增生物激活受體(PPARγ)激活脯氨酸氧化酶，形成過氧化物上調Beclin-1，終引起自噬。在此過程中Beclin1的上調需要脯氨酸氧化酶產生的ROS；另一種新的自噬調控因子，染色質相關的核蛋白HMGB1在饑餓誘導的細胞自噬中有重要作用，ROS和Beclin-1參與HMGB1對自噬的調控。在饑餓狀態下，細胞內ROS含量增多，通過與ROS相關的信號途徑可以促使細胞核內的HMGB1向胞質轉運，在細胞質中HMGB1取代Beclin-2直接與Beclin-1相互作用，進而上調自噬水平。
mTOR和classⅢPI3K對自噬有調控作用，ROS可通過它們對自噬產生影響。例如，在U251型人腦膠質瘤細胞中，H2O2通過激活classⅢPI3K/Beclin1信號通路，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路中的Akt和mTOR的活性，誘導自噬，對自噬有調節功能的Beclin-2也參與其中。
促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)也與自噬形成相關。水飛薊素(silibinin)可以誘導HT1080型人纖維肉瘤細胞發生自噬型細胞死亡，這一過程受ROS-p38的介導，p38是MAPK蛋白家族成員，ROS-p38信號途徑激活p53引起自噬型細胞死亡。
此外在MES-13型腎小球系膜細胞中，鎘(cadmium，Cd）誘導自噬產生，這一過程受3β糖原合成酶激酶(GSK-3β)信號途徑調節。ROS還能與一些離子通道蛋白互作，影響一些離子(Ca2+、K+等)的正常轉運，而Hoyer-Hansen等認為Ca2+含量的增加能有效誘導自噬，說明ROS可能通過影響細胞內Ca2+含量而誘導自噬。
一種p53靶基因編碼的蛋白TP-53誘導的糖酵解和凋亡調控因子(TIGAR)能夠間接的降低ROS水平，阻礙自噬產生。抑制TIGAR的表達，則能促進ROS依賴型自噬的產生。
ROS的作用是廣泛的，其誘導自噬的信號通路不止一條。ROS信號可能通過某一條或者多條信號通路引起自噬，分子機制非常復雜。另外，究竟通過哪條信號途徑誘導自噬還受到多種因素的影響，如細胞型、受刺激類型、實驗環境等。另外，在自噬的調控過程中究竟哪一種ROS起作用，也值得去探究。一些研究者認為H2O2是調控自噬的主要ROS，但Chen等認為超氧陰離子是調控自噬的主要ROS。
3 ROS介導的自噬與疾病
隨著對自噬研究的不斷深入，越來越多的研究表明自噬與多種疾病有關聯，而在一些疾病中也檢測到較高水平的ROS。在腫瘤、神經退行性等疾病中，ROS誘導的自噬對疾病的產生和發展有著重要作用。
3．1腫瘤
腫瘤細胞普遍處于缺氧狀態，缺氧誘導因子(HIF-1)在細胞對缺氧的應答中起關鍵作用。在氧含量正常的情況下蛋白酶體降解HIF-1，抑制其活性，但在腫瘤細胞中線粒體產生的ROS可以使HIF-1穩定的存在。HIF-1能夠活化BNIP-3(Bcl-2/E1B-19K-interactingprotein3)和NIX(BNIP3類似物)，活化的BNIP-3和NIX與Beclin-2結合，釋放Beclin-1誘導自噬產生，自噬可以減少ROS的生成和線粒體的聚集，有利于腫瘤細胞在缺氧條件下存活，對腫瘤有促進作用；饑餓或者雷帕霉素處理的HeLa細胞自噬過程中活化的NADPH氧化酶產生的ROS能夠激活JAk2/STAT3(Janus激酶/信號轉導子與轉錄激活子3)途徑，自噬過程通過活化JAk2/STAT3和隨后分泌的生長因子促進癌細胞存活。另外Red-Br-nos(微管蛋白結合物諾斯卡品的類似物)能夠誘導前列腺癌細胞PC-3產生自噬，并釋放ROS，清除ROS會降低自噬水平。在多發性骨髓瘤細胞中，HYD1(一種D-氨基酸肽)誘導的自噬有助于癌細胞的存活，ROS清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸能夠抑制HYD1誘導的自噬，這些均表明ROS在癌細胞自噬的產生過程中起重要作用。而且在一些癌細胞中，自噬作為細胞凋亡的抵抗機制，也有促進癌細胞存活的作用。例如，冬凌草素甲能誘導鼠科纖維肉瘤細胞產生ROS、自噬和凋亡，抑制自噬促進細胞凋亡，而促進自噬能促進癌細胞存活。
另據Gao等報道，有抗癌作用的塞來昔布(celecoxib)衍生物OSU-03012誘導肝癌細胞產生自噬型細胞死亡，且ROS的積累與自噬的產生相關。表明自噬具有抗癌作用，這與其促進癌細胞存活的作用相反。
綜上所述，自噬對癌細胞有雙重作用，但都與ROS有關，究竟是促進還是抑制腫瘤，存在諸多爭議。但應當看到，適度的自噬對癌細胞的存活是有利的，一旦自噬水平超過一定閾值，則會造成癌細胞的死亡，抑制腫瘤生長，而ROS能夠影響自噬水平，因此推測ROS也是決定癌細胞存活的因素。
3．2神經退行性疾病
自噬能夠清除并降解在帕金森病(PD)和阿爾茨海默病中產生的有害蛋白質。許多情況下，在神經退行性疾病中能夠觀測到氧化應激增強及ROS的生成，造成自噬水平的升高。例如在多巴胺D(2)受體敲除的PD小鼠模型中，氧脅迫(oxidative stress)的增強和聚合α-共核蛋白的形成(α-synuclein)與升高的自噬水平相關。Alessandro等發現，PD患者的外周血單個核細胞(PBMC)中經硝基酪氨酸（NT)修飾的α-共核蛋白的聚集性增強，其含量與細胞內ROS的濃度相關，而且PBMC中自噬水平顯著升高。
β-淀粉樣蛋白是AD的主要致病因子，并能誘導自噬，此過程受ROS介導。自噬導致溶酶體中β-淀粉樣蛋白的累積，造成溶酶體膜通透性增加，終可能引起細胞凋亡。
4衰老
衰老是一種重要的生理現象，細胞和組織中的不利變化隨時間流逝而不斷積累引發衰老，其自噬功能會不斷減弱，終會導致死亡。在一些長壽命細胞內，如心肌細胞、神經元細胞，脂褐質會隨時間不斷產生并沉積下來，阻礙線粒體的自噬，致使衰老的線粒體累積，產生更多的ROS，氧化應激的不斷增強，反過來繼續損傷線粒體和溶酶體，激發促凋亡途徑，終導致細胞死亡。因此，清除損傷線粒體的自噬，即線粒體自噬有抗衰老的作用。此外，在衰老的酵母細胞內，人類精液中的亞精胺組分能可通過抑制組蛋白?；D移酶（HAT)活性而觸發組蛋白H3的漸進性脫乙酰基作用，進而抑制氧化應激。這種染色質乙?；癄顟B的變化能上調多種自噬相關的轉錄物，促進自噬水平升高，從而延長壽命。
5討論
綜上所述，ROS誘導的自噬在一定范圍內對機體有積極作用，但過量的ROS會誘導自噬型細胞死亡，對機體產生不利影響。盡管許多ROS介導的自噬產生途徑被發現，但是對完整的信號轉導途徑仍缺乏清晰的認識，需要不斷深入研究，以完善相關信號通路。另外存在多種ROS，它們是單獨的調控自噬，還是一起作用于自噬，存在爭論!需要找到或開發出更為準確的探測和標記各種ROS的方法，以便更為準確的認識它們各自在自噬中的具體作用。可以看到，ROS和自噬在細胞內的作用非常廣泛，信號通路異常復雜，而且與人類健康密不可分，但將現有的并不完整的理論應用到臨床治療上是非常危險的，在這方面應當謹慎對待。