劉壘馮杜朱玉山陳佺
《中國細胞生物學學報》2012年10期
【作者單位】：中國科學院動物研究所；南開大學生命科學學院
【摘要】：
線粒體自噬(mitophagy)是指細胞通過自噬的機制選擇性地清除線粒體的過程。選擇性清除受損傷或功能不完整的線粒體對于整個線粒體網絡的功能完整性和細胞生存來說十分關鍵。線粒體自噬的異常和很多疾病密切相關，因此對于線粒體自噬的具體分子機制以及生理意義研究有很重要的生物學意義。線粒體自噬的研究是目前生物學領域的研究熱點，該文主要綜述了近年來在線粒體自噬領域取得的研究進展，旨在為相關領域的研究提供參考。
1線粒體自噬的概述
線粒體決定細胞的生存和死亡。一方面，線粒體是細胞的能量工廠，通過氧化磷酸化為細胞的生存提供能量和生物合成的底物；另一方面，線粒體代謝過程中活性氧的異常積累會引起線粒體損傷，從而釋放促凋亡蛋白，如細胞色素C和其它凋亡因子等。細胞色素C釋放能引起凋亡蛋白復合體(apoptosome)的形成和Caspase-9的激活，并通過一系列級聯放大反應來活化下游的Caspase家族蛋白，啟動細胞的凋亡過程。
為維持細胞的正常活動狀態，受損傷或不需要的線粒體需被及時清除掉。新的研究表明，細胞主要通過自噬機制選擇性地清除受損傷或不需要的線粒體，這一過程被稱為線粒體自噬(mitochondrial autophagy或mitophagy)。早在1962年就有文獻報道，體外灌注的大鼠肝臟用胰高血糖素處理15min后，通過電鏡觀察發現了很多被膜結構包裹的線粒體，并且這些線粒體隨后會被溶酶體降解掉。但線粒體自噬這一概念由Lemasters于2005年正式提出。他觀察到線粒體膜電位降低和線粒體通透性膜孔開放能引起線粒體自噬，并認為線粒體自噬可能在減少由衰老引起的線粒體DNA突變中起著重要的作用。越來越多的研究表明線粒體的清除是一個選擇性的過程，線粒體自噬的研究是目前細胞生物學和線粒體研究領域的熱點課題。線粒體自噬的異常與多種疾病包括神經退行性疾病、血液病和心血管疾病甚至癌癥的發生有密切關系。研究線粒體自噬的分子調控機制將有助于了解這些疾病的發生機制和尋找新的疾病預防及治療的策略。
2線粒體選擇性自噬的機制
2．1酵母中線粒體自噬的調控機制
自噬主要的生理功能是能夠將胞質中的大分子物質和一些損壞的細胞器通過溶酶體途徑降解，實現能量的再循環，以維持細胞自身的穩定。自噬分為三種類型，分別是大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperonemediated autophagy，CMA)。目前研究尤其充分的是大自噬，大自噬是指長壽命蛋白或細胞器被雙層膜結構的自噬小泡包裹起來，并且和溶酶體發生融合并降解的過程。自噬的早期研究主要是利用酵母開展的，前期的研究工作鑒定出了一系列參與自噬過程的蛋白質，這些蛋白都被命名為Atg(autophagy-related gene)家族蛋白。目前為止已經發現了36種Atg家族蛋白，這些蛋白在自噬的不同階段發揮著重要的作用。其中Atg6通過和VPS34形成復合物參與了自噬的起始階段。自噬體的延伸需要兩個蛋白結合系統，這兩個系統各含有一個泛素類似的蛋白Atg12或Atg8。Atg12能夠和Atg5及Atg16形成一個大的復合物，而Atg8能夠在Atg4、Atg3和Atg7的幫助下和一個膜脂成分磷脂酰乙醇胺(PE)結合，兩者都參與了自噬小泡的延伸。在饑餓的情況下，酵母也會發生典型的線粒體自噬。酵母中可以很方便地進行大規模的篩選實驗，因此，酵母線粒體自噬的調控機制研究取得了很多進展。Uth1p是很早發現的調控酵母線粒體自噬的一個蛋白，它是一個線粒體外膜蛋白，Uth1p基因的缺失能夠抑制由饑餓或者雷帕霉素引起的酵母線粒體蛋白的降解，提示這個蛋白在線粒體選擇性清除中起著關鍵的作用。隨后又發現另一個位于線粒體膜間隙的蛋白Aup1p也參與了酵母的線粒體自噬，Aup1p是一種磷酸酶，它參與了酵母細胞生長平臺期發生的線粒體自噬的調控。
近期Klionsky和Ohsumi實驗室同時鑒定出了一個參與酵母線粒體自噬調控的新蛋白，這個蛋白被命名為Atg32。Atg32是一個線粒體外膜蛋白，其N末端定位于胞漿，C末端位于線粒體膜間隙。在非發酵的甘油培養基中培養時，當酵母進入對數生長后期后，就會發生線粒體自噬從而降解掉一部分線粒體，而Atg32缺失的酵母能夠幾乎完全抑制這種線粒體自噬的產生。Atg32的缺失并不會影響饑餓引起的自噬水平，只是特異地參與了線粒體自噬的調控。在線粒體自噬被誘導后，Atg32能夠和參與細胞自噬的關鍵蛋白Atg11相互作用。在Atg32的胞漿區域還具有典型的Atg8結合區域即LC3相互作用區域(LC3 interacting region，LIR)，通過實驗證實Atg32和Atg8有直接的相互作用，Atg32可能通過和隔離膜(isolation membrane)上的Atg8及Atg11的相互作用，使得線粒體逐漸被自噬小泡包裹從而被降解掉，并且Atg32和Atg11的相互作用受到了Atg32的114位絲氨酸磷酸化的調節，蛋白激酶Hog1和Pbs2通過調控未知的蛋白激酶對Atg32的磷酸化能夠促進Atg32和Atg11的相互作用和線粒體自噬的發生。
Atg32在哺乳動物里沒有同源蛋白，這說明哺乳動物里還有其他的基因參與了線粒體自噬的調控，下面將主要介紹參與哺乳動物線粒體自噬調控的蛋白。
2．2 Parkin依賴的線粒體自噬的調控
線粒體膜電位的降低可能導致線粒體自噬。體外培養的肝細胞在饑餓的情況下能觀察到快速的線粒體被降解的情況，而用線粒體MPT孔的抑制劑CsA能夠在抑制膜電位降低的同時抑制線粒體自噬的發生。近期的研究表明，Parkin和Pink1蛋白參與了膜電位降低引起的線粒體自噬的發生。
Parkin是一個E3泛素連接酶，Pink1是一個絲氨酸/蘇氨酸激酶，位于Parkin的上游發揮作用。Pink1能磷酸化Parkin，促進Parkin由胞漿到線粒體的轉位，Parkin和Pink1功能喪失的點突變和帕金森綜合征的發生有密切的關系。
美國Richard Youle實驗室研究發現，Parkin能被選擇性地募集到膜電位降低的線粒體，并且介導線粒體被自噬體包裹。Pink1和Parkin有相互作用，Pink1在損傷的線粒體上的積累能為Parkin選擇性降解線粒體提供信號(圖1)。Parkin被募集到線粒體上后能通過介導VDAC1的泛素化參與線粒體的自噬，在這個過程中p62也被募集到線粒體上，啟動了線粒體自噬。但也有文章表明，p62只參與了Parkin介導的線粒體聚集而與線粒體自噬沒有關系，而VDAC1在線粒體自噬中的作用尚有爭論。Parkin和Pink1還能通過協同降解Miro蛋白影響線粒體運動，從而在損傷的線粒體被降解之前先阻滯了其運動，而在損傷的線粒體上Pink1和TOM復合體形成一個700kDa左右的復合物，參與了Parkin介導的線粒體自噬的調控。同時果蠅里的研究表明，Parkin和Pink1能介導和線粒體融合有關的蛋白Mfn的泛素化，Parkin或Pink1缺失的情況下，Mfn的蛋白量增加，從而促進了線粒體的融合，而Mfn的泛素化也可能是線粒體自噬的信號，泛素化的Mfn被清除后，線粒體的融合功能喪失，隨后會通過自噬被降解掉。而在哺乳動物中的研究發現，線粒體分裂有關的蛋白Drp1是Parkin的底物，敲減Parkin后會引起線粒體的破碎。關于Pink1在線粒體自噬中的作用，也有相反的報道，在SH-SY5Y細胞里面敲減Pink1后能引起線粒體的片段化，而高表達Pink1能增加線粒體的融合程度并抑制藥物引起的線粒體自噬。所以，關于Parkin和Pink1在線粒體動態變化以及損傷的線粒體被選擇性清除的過程中所扮演的角色和具體機制仍有待更深入的研究。
2．3缺氧介導的線粒體自噬的調控
我們新的研究表明，線粒體外膜蛋白FUNDC1參與了缺氧介導的線粒體自噬。FUNDC1是一個三次跨膜蛋白，定位在線粒體外膜上，在FUNDC1高表達的情況下能夠引起明顯的線粒體自噬，并且FUNDC1引起的線粒體自噬是Atg5依賴的。FUNDC1存在保守的LIR結構域，并且依賴LIR和自噬的關鍵分子LC3相互作用，來介導低氧誘導的線粒體自噬。LIR保守結構域的突變或缺失能夠抑制其與LC3的相互作用和線粒體自噬。FUNDC1高表達引起的線粒體自噬在Atg5敲減的細胞里受到了明顯的抑制，而Beclin1的敲減并不能抑制FUNDC1引起的線粒體自噬，提示FUNDC1引起的線粒體自噬和文獻報道的神經毒性藥物MPP(+)引起的線粒體自噬一樣，都是Beclin1非依賴的。進一步的機制研究表明，FUNDC1的磷酸化在線粒體自噬調控中發揮了關鍵作用。在正常情況下，FUNDC1能被蛋白激酶Src磷酸化，而磷酸化的FUNDC1和LC3的相互作用比較弱，FUNDC1的功能受到抑制。在低氧情況下，蛋白激酶Src的活性降低，導致FUNDC1磷酸化水平的降低，從而促進其與LC3相互作用和線粒體自噬的發生。
像Atg32一樣，FUNDC1介導的線粒體自噬也受到磷酸化調控，這進一步說明了線粒體自噬機制在進化上的保守性(圖2)。FUNDC1作為新的線粒體自噬受體的發現使我們有機會進一步研究哺乳動物細胞線粒體自噬的調控機制。有必要進一步分析FUNDC1介導的線粒體自噬與Parkin介導的線粒體自噬的相互關系及FUNDC1的生理功能及其與疾病發生的關系。
2．4 Bnip3/Nix介導的線粒體自噬
Bnip3蛋白及其同源蛋白Bnip1和Bnip2起初是利用腺病毒的E1B 19kDa蛋白做誘餌通過酵母雙雜交鑒定出來的，這些蛋白能和E1B 19kDa蛋白以及Bcl2蛋白相互作用。隨后一系列的文章證明了Bnip3具有誘導細胞死亡的作用。Bnip3能形成穩定的二聚體，并且C端的跨膜區對于其在線粒體的定位是必需的，高表達Bnip3能誘導大鼠的成纖維細胞和MCF-7細胞的凋亡，而Bn中3跨膜區缺失的突變體不能誘導凋亡。Bn中3除了在細胞死亡中發揮著重要的作用，同時它也是細胞自噬乃至線粒體自噬過程中的重要參與者。膠質瘤用Ceramide或Arsenictrioxide處理后會出現典型的自噬性細胞死亡，Bnip3在這種情況下的表達量有明顯的升高，而且腫瘤細胞直接轉染Bnip3能出現很明顯的自噬現象。在缺血再灌注模型中，Bnip3功能缺失的突變體能夠起到保護作用，而用Atg5 K130R抑制自噬會使細胞死亡增加。所以，Bnip3在缺血再灌注損傷的情況下會激活自噬反應，后者清除損傷的線粒體，可能會起到一種保護作用。近期的研究表明，Bnip3和自噬的關鍵蛋白LC3有直接的相互作用，介導了線粒體自噬的發生。
紅細胞成熟的過程中需要有線粒體等細胞器的選擇性清除，因此紅細胞的成熟過程為線粒體自噬提供了一個很好的研究模型。Nix和Bnip3在蛋白序列上有56％的同源性，并且在人的各個組織里廣泛表達，而且在腫瘤細胞里高表達Nix能明顯抑制細胞的增殖。Nix的表達量在紅細胞分化成熟中顯著上調，這可能和Nix在紅細胞成熟過程線粒體通過自噬被清除的過程中扮演著重要的角色有關系。Nix敲除的小鼠存在成熟紅細胞的減少和幼稚粒細胞的增加，而且這種小鼠紅細胞里面的線粒體仍然存在，說明在Nix缺失的情況下紅細胞成熟過程中線粒體的清除發生了障礙。Nix被誘導后通過某些未知的原因引起線粒體膜電位下降，從而激活自噬機制，引起線粒體被選擇性地清除。進一步的研究表明，Nix可能是一個線粒體自噬的直接受體，它能夠和LC3蛋白直接結合，并募集LC3到損傷的線粒體上引起線粒體自噬的發生。
Ulk1是酵母Atg1基因在哺乳動物中的同源蛋白。新的研究表明，Ulk1作為一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在紅細胞成熟過程中對線粒體的選擇性清除發揮著重要的作用。在Ulk1基因敲除的小鼠血液里未成熟的網織紅細胞明顯增加，并且出現一種和網織紅細胞一樣有線粒體存在的CD71陰性的紅細胞，而且在體外培養的條件下，Ulk1基因缺失的網織紅細胞的線粒體的清除有所減緩。但是，Ulk1的缺失并不能抑制饑餓引起的自噬的發生，表明Ulk1參與了紅細胞成熟過程中線粒體選擇性清除的過程。
另外一個自噬的關鍵蛋白Atg7也參與了紅細胞發育過程中的線粒體自噬，在血液系統中特異地敲除和自噬有關的基因Atg7后，小鼠紅細胞中線粒體的清除發生障礙，導致很多損傷的線粒體的堆積，引起紅細胞死亡從而導致小鼠產生嚴重的貧血。
2．5線粒體融合分裂及相關蛋白和線粒體自噬的關系
一些研究也發現，和線粒體融合與分裂有關的蛋白質也參與到了線粒體自噬過程中。線粒體分裂后通常會產生兩個不均勻的子代。其中部分線粒體能恢復膜電位，并能與其他線粒體發生融合，成為線粒體網絡的一部分。有些線粒體膜電位不能恢復，膜電位下降的線粒體就會被選擇性地通過自噬降解。高表達促進線粒體融合的蛋白OPA1能抑制線粒體自噬的發生。看來線粒體融合不僅能拮抗線粒體分裂，也能阻止線粒體自噬。這三者間存在一種動態平衡來調控線粒體質量。
Fis1也是一個和線粒體分裂有關的蛋白，它能與線粒體分裂有關的蛋白Drpl相互作用來促進線粒體的分裂。有研究表明，Fis1也可能參與了線粒體自噬的調節，高表達Fis1以及它的一個突變體都能夠促進線粒體自噬的發生。
總之，在哺乳動物細胞里面有很多蛋白參與了線粒體的自噬，既有自噬過程中的關鍵分子如Ulk1和Atg7，也有與線粒體形態變化有關的蛋白Fis1和Parkin。與細胞死亡有關的蛋白Bnip3和Nix，以及參與了缺氧介導的線粒體自噬的FUNDC1都定位在線粒體上并且和自噬中的關鍵蛋白LC3有直接的相互作用，是介導線粒體自噬的關鍵受體蛋白(圖3)。這些蛋白一起協同參與了線粒體自噬的發生，并且這些蛋白可能在線粒體自噬的不同階段發揮著重要的調節作用。
3線粒體自噬的生理意義
3．1線粒體自噬的重要性
線粒體主要通過電子傳遞鏈產生ATP為機體提供生存所需的能量，但是在電子傳遞的過程中也有副產物活性氧(ROS)的出現，ROS包括過氧化物、羥自由基以及過氧化氫。ROS能攻擊蛋白質、脂肪酸和核酸并且啟動過氧化的連鎖反應。因此，損傷的線粒體需要被及時地清除掉，否則其可能會對細胞造成更嚴重的危害。選擇性的線粒體自噬在線粒體的清除中發揮著重要的作用。MPT孔的開放能夠促進線粒體自噬的發生，MPT孔的抑制劑CsA能夠阻止MPT線粒體的去極化，并且能抑制線粒體自噬的發生，在這種情況下損傷的線粒體能通過線粒體自噬被清除掉。
3．2線粒體自噬和衰老
線粒體自噬和細胞的衰老也有關系。線粒體是一個持續的ROS的來源地，這些ROS導致mtDNA的突變，線粒體DNA的修復能力不強，使得這些突變逐漸積累。線粒體DNA的突變可能削弱氧化磷酸化關鍵的蛋白的合成，會導致產能衰竭和細胞死亡。因此，通過線粒體自噬清除功能喪失的線粒體能夠抑制細胞的衰老。隨著機體的衰老，細胞的自噬機制也逐漸減弱，使損傷的線粒體逐漸堆積，會加劇衰老。
3．3線粒體自噬和紅細胞及淋巴細胞發育
近期一系列的研究發現，幾個與自噬有關的基因(Atg7、Ulk1)以及與細胞凋亡有關的基因(Nix)參與了紅細胞成熟過程中線粒體的選擇性清除過程。在這些基因敲除的小鼠中都存在紅細胞成熟障礙，紅細胞中線粒體的清除受到了影響，從而使得紅細胞的功能也受到了抑制，導致了貧血或者其他的一些血液系統疾病。同樣，線粒體自噬在T淋巴細胞的發育成熟過程中也起著重要的作用。在Atg7敲除的小鼠中，T淋巴細胞的線粒體清除發生障礙，從而使得細胞里的活性氧的產生增加，并且導致T淋巴細胞的功能障礙以及凋亡。
3．4線粒體自噬和神經系統疾病
線粒體自噬對于神經系統的發育和功能的維持也是很重要的。神經細胞依賴于自噬來控制蛋白的質量并且移除損傷的線粒體。在正常的情況下，線粒體自噬能起到保護神經細胞的作用，然而有時線粒體自噬的調節失常會導致神經退行性疾病。線粒體功能的喪失可能在帕金森癥的發生中起著重要的作用，而Parkin對于維持線粒體的正常功能是很關鍵的。Parkin能夠選擇性地被募集到膜電位下降的線粒體上，從而介導線粒體的自噬，清除掉功能喪失的線粒體。而在帕金森癥中經常存在著Parkin蛋白的突變而導致的功能喪失，Parkin的功能喪失會引起線粒體自噬的缺陷，從而導致帕金森癥的發生。
在一種Purkinje細胞降解(Purkinje cell degeneration，PCD)小鼠中的研究發現，線粒體的過度自噬還和Purkinje細胞的逐漸消失有著密切的關系。這種小鼠有顯著的神經共濟失調，這種共濟失調主要是由于99％的Purkinje細胞在小鼠出生后3周內就消失而造成的。這種小鼠的Purkinje細胞自噬明顯被上調，從而選擇性地降解線粒體，因為線粒體被過度地降解，使得Purkinje細胞發生能量崩潰，導致Purkinje細胞的死亡。然而在這種小鼠的Purkinje細胞里線粒體的形態是異常的，所以也有可能是因為其他原因導致了線粒體功能的異常，使得線粒體的自噬水平升高，所以線粒體自噬在這個病理過程中仍然是起到了保護作用。
總之，線粒體自噬是細胞一個十分重要的過程，線粒體自噬的存在對于調控細胞內環境的穩定十分必要。目前對線粒體自噬的研究剛剛起步，其中的分子機制遠不清楚，而且線粒體自噬和機體發育生長以及疾病之間的關系仍然不是特別明了。我們新鑒定的線粒體自噬的受體將很大地推動線粒體自噬調控機制及線粒體質量控制在疾病發生中的作用的研究。