劉曉蓉1，謝有梅2，張成1，王展航1，張為西1，盧錫林1，蘇全喜3
收稿日期：2001-09-08；修訂日期：2001-12-27
摘要：
目的：
研究mdx鼠體內骨骼肌細胞凋亡情況，探討凋亡對Duchenne型肌營養不良癥(DMD)的發生發展所起的作用。
方法：
采用流式細胞儀碘化丙啶(PI)排斥法測定不同滲透壓下成肌細胞的凋亡數目，用TUNEL法測定不同鼠齡的mdx鼠骨骼肌細胞的凋亡情況。
結果：
mdx鼠的成肌細胞在外界滲透壓變化的情況下，發生凋亡的細胞數較C57鼠明顯增加，且隨mdx鼠鼠齡的增長而增加。
結論：
抗肌萎縮蛋白(dys)的缺失引起的凋亡在DMD疾病的啟動和病程進展中可能起重要作用。
關鍵詞：mdx鼠；凋亡；抗肌萎縮蛋白
Duchenne型肌營養不良癥(DMD)是常見的X連鎖隱性遺傳病。3～4歲起病，以進行性四肢骨骼肌萎縮無力伴小腿腓腸肌假性肥大為特征，同時累及心肌和呼吸肌，多于未成年死亡，病因是位于Xp21的抗肌萎縮蛋白(dys)基因突變引起細胞骨架蛋白dys缺失。以往人們認為dys的缺失主要引起骨骼肌細胞的變性、壞死及炎癥細胞浸潤，但近來逐漸發現凋亡在骨骼肌萎縮性疾病中起著重要作用。本文通過對DMD動物模型mdx鼠的骨骼肌凋亡情況的研究，探討凋亡在DMD發病過程中的作用。
1材料與方法
1．1實驗對象及分組
實驗共分兩組：
對照組：出生3d以內的C57乳鼠15只，4～8周的C57鼠8只；
實驗組：出生3d以內的mdx鼠15只，1個月的mdx鼠，3個月的mdx鼠、6個月的mdx鼠各8只。
C57鼠購自中山醫科大學實驗動物中心，mdx鼠購自美國Jackson實驗室。所有動物為二級以上動物，雌雄不限，飼養于清潔級動物實驗室。
1．2成肌細胞的培養，鑒定和流式細胞儀檢測凋亡
取出生3d以內的C57和mdx乳鼠引頸法處死，去皮后取四肢的骨骼肌各分6瓶進行成肌細胞培養，用差速貼壁法進行純化，純化后的細胞以1×105/ml的密度分別接種于75ml的培養瓶里，分別加入高滲透壓培養液(普通高糖DMEM培養基中加入等體積的50％的葡萄糖溶液)，正常滲透壓培養液(普通高糖DMEM)、低滲透壓培養液(普通高糖DMEM培養基中加入等體積的無菌三蒸水)，在5％CO2，37℃的條件下松口培養。7d后胰酶消化，0．4％的臺盼藍染色計數細胞存活比例，用SP免疫組化法進行Desmin染色，DAB顯色。另外，用流式細胞儀碘化丙啶(PI)排斥法進行凋亡檢測，計算凋亡細胞的比例。
1．3成年鼠骨骼肌細胞凋亡的檢測
引頸法處死C57鼠和mdx鼠，取四肢肌肉，OCT包埋，冷凍切片，丙酮固定。采用TUNEL法染色，BCIP/NBT顯色，甲基綠復染正常胞核，伊紅襯染胞漿。100倍放大倍數下隨機選擇5個視野進行圖像分析，計數凋亡核和正常細胞核數目，按如下公式計算凋亡核占總細胞核數的比例。凋亡核比例＝凋亡細胞核數/(凋亡核+正常細胞核)
1．4試劑與儀器
DMEM培養基(Gibcol)、胎牛血清(杭州四季青公司)、ELITE型流式細胞儀(Beckman Coulter)、冷凍切片機(Leka CM1850型，，SP免疫組化檢測試劑盒(福州邁新試劑公司)、細胞凋亡原位檢測試劑盒(Roche)、兔抗鼠desmin抗體(博士德公司)、IBAS 2．5全自動圖像分析系統(德國KONTRON)、Ky-F30B 3-CCD彩色圖像搔錄輸入儀(日本JVC)。
1．5統計方法
采用組間t檢驗。
2結果
2．1成肌細胞培養及鑒定
C57鼠和mdx鼠的成肌細胞培養7d時已鋪滿培養瓶底，細胞均呈長梭形，體積大小較均一。兩組細胞在生長速度和形態上無明顯差別。經過胰酶消化、臺盼藍染色后，兩組成肌細胞存活率均在99％以上。將細胞涂片進行Desmin染色后可見：為梭形、多核細胞。胞漿被染成棕黃色，胞核不染色或被染成淡黃色，證明此種細胞具有Desmin的形成，是成肌細胞，兩組細胞的形態及染色結果無明顯差別。
2．2成肌細胞的凋亡
PI排斥法計數1．2×105個細胞中凋亡細胞所占的比例，在正常滲透壓下，mdx鼠的成肌細胞凋亡數與C57鼠相差不明顯，分別為1．2％和1．1％，且G2期、M期細胞較多，細胞增殖明顯，但在低滲的情況下，C57鼠細胞的凋亡效無明顯增加(0．6％)，而mdx鼠的成肌細胞凋亡數目增加了一倍(2．5％)；在高滲的情況下，C57鼠的凋亡數目明顯增加(8．6％)，但mdx鼠凋亡細胞增加的程度遠遠超過了C57鼠，達到了10．8％。說明mdx鼠的成肌細胞在細胞外滲透壓變化時，凋亡數目明顯增加；而G0期、G1期細胞數目變化不明顯，G2期、M期細胞減少，細胞增殖減少。
2．3成年鼠的骨骼肌細胞凋亡情況
用TUNEL法險測骨骼肌細胞的凋亡情況，發生凋亡的細胞校被染成藍紫色，而正常細胞核呈綠色，胞漿呈淡紅色，結果顯示：C57鼠正常情況下幾乎無凋亡細胞，而mdx鼠的骨骼肌細胞的凋亡數目明顯高于C57鼠，凋亡細胞核和胞漿固縮、變形，與鄰周細胞脫離，凋亡小體形成，且大部分凋亡細胞核主要位于細胞間質。圖像分析顯示：凋亡隨著鼠齡的增長而增加，C57鼠、1個月的mdx鼠、3個月的mdx鼠、6個月的mdx鼠的凋亡細胞核比例分別為2％、5％、25％、42％。各組之間比較差異顯著(P<0．05)。
3討論
本研究中所使用的mdx鼠，是X染色體上dys基因的23號外顯子(dys23)發生單個堿基替代，而引起點突變，導致dys缺乏，具有與DMD患者相似的發病分子基礎，經過多項研究已證明其具有DMD疾病變化的典型的變性、壞死的病理基礎，是一種研究DMD疾病的理想的動物模型，所以，用mdx鼠來研究DMD的凋亡情況是合理的。
目前人們通過對DMD患者的病理研究確認了該病骨骼肌的變性、壞死明顯增多，但對壞死是如何啟動的知之甚少。同時，人們雖對凋亡本身的啟動及發生演變機制有了一定了解，但對于骨骼肌中凋亡的研究卻起步晚、認識少，1995年Rodrigues等在電鏡下觀察到去神經比目魚肌出現凋亡的形態學改變后，人們才對凋亡在肌病中所起的作用引起重視。1995年Matsuda等初次提供了DMD的肌纖維中存在凋亡的證據，從而引發了人們對DMD中凋亡的研究，本研究結果證明dys的缺乏可以引起肌細胞的凋亡數目增加。
一方面，凋亡肌細胞的增加與細胞滲透壓變化有關。在成肌細胞階段，C57鼠和mdx鼠只有少部分細胞凋亡，可能是維持細胞正常生長和循環的一部分。在細胞外滲透壓改變時，mdx鼠的凋亡細胞數較C57鼠明顯升高，說明dys的缺乏可引起肌細胞膜通透性增加，使mdx鼠的成肌細胞對外界滲透壓變化更加敏感，從而誘導凋亡細胞數目增多。也說明dys的缺乏對成肌細胞階段的細胞生理就已經產生了一定影響，使細胞在外界環境變化時更加脆弱。另一方面，凋亡隨年齡的增長而增加，C57成年鼠的細胞凋亡數目較成肌細胞階段無明顯升高，面對于mdx鼠，凋亡細胞數目隨著鼠齡的增加而逐漸增加，且較C57鼠肌細胞的凋亡數目明顯增多。這與Sandri等的研究結果一致。
由以上推斷，DMD的疾病進展可能與肌細胞凋亡的增加有重要關系：一方面，凋亡的變化過程與DMD疾病的病程相一致，DMD雖是遺傳性疾病，但DMD患者在起初的3～4年間發育正常、無癥狀，而此時骨骼肌細胞的凋亡數目少，凋亡只是維持正常生長代謝的一部分。但是，隨著年齡的增長，肌細胞中的凋亡逐漸增加，患者癥狀出現并逐漸加重，在mdx鼠6個月時(相當于患者的20歲左右)，凋亡細胞數已達40％之多。有研究證明在體外誘發肌細胞凋亡后的8h內，細胞內CPK活性逐漸喪失至不可檢測的水平。說明凋亡的啟動導致了肌細胞內肌酶的滅活或泄露。CPK、CK-MB在疾病早期、肌壞死出現之前就已出現，很可能是細胞發生凋亡所致。Mikhailov等多人的研究也證明，在運動后，mdx鼠的肌細胞凋亡明顯增加，推斷DMD患者之所以在3～4歲才出現癥狀可能與這一時期患者的活動增加、肌肉負荷增加而誘導的凋亡增加有關。所以，凋亡的啟動可能是疾病發生的始動環節，是繼發引起肌細胞變性、壞死的重要原因，另一方面，肌間質細胞凋亡的增加導致肌細胞再生困難。凋亡細胞主要位于肌間質，而成人或成年鼠的肌細胞再生主要依靠存在于間質的肌衛星細胞，其凋亡使衛星細胞數目減少，病損肌肉的再生和修復受到影響，繼發性引起正常肌細胞數目減少，從而使疾病呈進行性發展。
目前對于dys的缺失如何引起凋亡的機制尚不清楚。筆者認為可能有以下幾種原因：
(1)Ca2+通道異常：DMD患者肌細胞內Ca2+顯著增加，肌膜Ca2+-ATPase活性增加，使細胞鈣超載，引起胞內溶酶體酶釋放而造成凋亡。鈣超載可能是引起凋亡的主要原因。
(2)膜不穩定：dys與dys復合物構成一個跨膜連接體，dys的缺乏可導致細胞骨架的不完整，時各種離子、蛋白的通透性增加，后者導致的細胞內滲透壓的變化有可能對凋亡的發生有一定作用，但具體機制尚待闡述。
(3)與炎癥相關：炎細胞浸潤在DMD肌肉中是常見現象。Spencer等發現：在運動后，mdx鼠的肌肉CTL和輔助T細胞浸潤增加，同時炎癥相關蛋白Perforin表達濃度升高。在dys基因和perforin基因雙敲除的動物模型中，幾乎役有凋亡發生，認為：CTL介導的炎癥反應對mdx鼠的肌纖維的凋亡和壞死有重要作用，pertorin可能是凋亡的起初啟動因素。
(4)NO因素：有人發現dys缺失導致肌肉相關蛋白的表達量異常，其中腦型一氧化氮合酶(nNOS)的表達及在膜上分布明顯減少，膜結合NOS活性降低，NO在肌纖維內明顯增多，而NO可誘導凋亡的發生。以上均是對mdx鼠和DMD患者肌細胞凋亡的可能解釋，其具體發生機制還有待于進一步探討。
總之，dys的缺乏可引起肌細胞的凋亡數目增加，且凋亡對于DMD的發病和病情進展起著一定的作用，可能是引起DMD發病的始動環節和貫穿病程的重要影響因素。