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范曉華紀樹榮周紅俊
《中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志》2007年07期
【作者單位】：山東省立醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)中心；
北京博愛醫(yī)院；
骨骼肌纖維是多核纖維，肌核的轉(zhuǎn)錄活動和/或肌核的數(shù)量發(fā)生變化時，基因物質(zhì)的含量可能發(fā)生改變，從而參與肌纖維蛋白含量與肌纖維體積的調(diào)節(jié)。神經(jīng)肌肉電活動減低和/或負荷的減少(如脊髓損傷、后肢懸吊與太空飛行、制動、失神經(jīng)支配等)可導(dǎo)致骨骼肌纖維發(fā)生顯著、快速的萎縮，并伴有細胞核的數(shù)量減少。肌核丟失的機制不明，可能與細胞凋亡有關(guān)。本文主要歸納肌纖維凋亡與骨骼肌萎縮的研究進展。
細胞凋亡在光鏡下不易區(qū)分。細胞凋亡分3個階段，即啟始階段、效應(yīng)階段及降解階段。在啟始階段，細胞內(nèi)或細胞外損傷與凋亡啟動刺激(如氧自由基產(chǎn)物或胞漿內(nèi)鈣離子內(nèi)流等)活化不同的途徑，啟動凋亡過程。促凋亡因子bax與抗凋亡因子bcl-2之間的失衡啟動線粒體途徑。效應(yīng)階段又分為線粒體途經(jīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途經(jīng)與死亡因子及其受體途經(jīng)。在效應(yīng)階段，線粒體膜的通透性增加引起促凋亡因子的釋放，如caspase活化因子(細胞色素C、hsp10)以及AIF。這些因子活化caspase水解級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致降解階段典型的形態(tài)學(xué)特征。如細胞骨架的重排、DNA碎片、膜的發(fā)泡、凋亡小體的形成。細胞是否發(fā)生凋亡是由氧化應(yīng)激水平?jīng)Q定的。
肌纖維凋亡概述
正常骨骼肌纖維呈細長圓柱形，有多個甚至幾百個橢圓形細胞核，細胞核位于細胞周緣。胞漿內(nèi)含有許多與細胞長軸平行排列的肌原纖維，肌原纖維之間有大量的線粒體、糖原及少量脂滴，肌漿內(nèi)還含有肌紅蛋白。快肌纖維細胞核的數(shù)量少于慢肌纖維。
骨骼肌在正常發(fā)育過程中，凋亡對肌細胞核的數(shù)量起重要的調(diào)節(jié)作用。包括人類在內(nèi)的哺乳動物，在胎兒肌纖維發(fā)育早期，有40％以上的肌細胞是通過凋亡清除的，說明正常骨骼肌發(fā)育中也存在凋亡現(xiàn)象。出生后骨骼肌與成年骨骼肌纖維內(nèi)，TUNEL陽性細胞核很少見，且沒有凋亡相關(guān)蛋白(如bcl-2家族或caspase家族)的表達，表明正常骨骼肌纖維的胞漿能夠抵抗細胞色素C-依賴的Ⅱ型caspase活化，且缺乏凋亡蛋白激酶活化蛋白-1(apoptosisproteasc activator protein-1，APAF-1)。
同一機體不同細胞譜系有不同的凋亡類型，因此多核肌纖維的凋亡，不同于單核細胞的凋亡。肌纖維內(nèi)的一個細胞核控制相連的數(shù)個肌節(jié)，一條肌纖維中，同一時間內(nèi)并非所有的核均表現(xiàn)為凋亡的DNA碎片，可能為單個肌細胞核的凋亡與相關(guān)肌節(jié)的降解，長此以往可導(dǎo)致肌纖維萎縮，如失神經(jīng)支配后骨骼肌失去神經(jīng)的營養(yǎng)作用、脊髓損傷后骨骼肌神經(jīng)肌肉電活動與負荷均減少。
病理狀態(tài)下，肌纖維促凋亡蛋白bax、caspases與抗凋亡蛋白bcl-2的表達均明顯上調(diào)，說明肌纖維既能啟動線粒體途經(jīng)的凋亡，又能啟動抗凋亡作用。Bax與bcl-2表達明顯上調(diào)，提示線粒體膜內(nèi)轉(zhuǎn)變小孔的通透性增加是啟動肌纖維凋亡的主要原因，bax與bcl-2的失衡可能起著決定性作用。而促凋亡因子FAS的表達、caspases以及其后降解階段發(fā)生的過程與肌纖維凋亡的關(guān)系，目前尚不明了。神經(jīng)肌肉疾病時(如失神經(jīng)支配、肌營養(yǎng)不良、先天性肌病等)caspase表達上調(diào)，慢性心衰或燒傷時骨骼肌caspase表達也上調(diào)，尤其是caspase-3可能是參與凋亡肌纖維降解的重要因子。凋亡特定蛋白(apoptosis-pecific protein，ASP)也稱為c-Jun/AP-1，是凋亡降解階段的一個標記物，在肌纖維凋亡的降解階段表達明顯上調(diào)，見于有邊緣空泡的遠端肌病。目前不知ASP的表達僅與凋亡有關(guān)，還是與自噬作用形成的邊緣空泡有關(guān)。
目前尚不清楚降解的肌細胞核與相關(guān)收縮成分是如何清除的。Fidzianska等發(fā)現(xiàn)，在嬰兒型脊髓肌萎縮內(nèi)，鄰近肌纖維吞噬凋亡小體包括降解的染色質(zhì)與凋亡肌纖維的收縮成分。也有研究發(fā)現(xiàn)，凋亡的肌纖維是由巨噬細胞或通過自噬作用清除的，自噬作用與邊緣空泡的形成有關(guān)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，肌節(jié)的降解可能早于肌細胞核的降解，蛋白水解作用可能參與肌節(jié)的降解。
肌纖維凋亡的機制至今尚不明了，可能與氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧自由基、一氧化氮、過亞硝酸鹽等有關(guān)，也可能與細胞漿內(nèi)Ca2+濃度、TNF-α等因素有關(guān)。Leeuwenburgh和Adhihetty等認為，氧自由基的產(chǎn)生可促使線粒體釋放細胞色素C，活化caspase-9，進而激活caspase-3，啟動肌細胞核的凋亡。細胞漿內(nèi)Ca2+濃度增高，可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑介導(dǎo)的凋亡通路。
肌纖維凋亡與骨骼肌萎縮
一、后肢懸吊引起的肌纖維凋亡
Allen等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠后肢懸吊后，比目魚肌(慢肌)肌纖維TUNEL標記的陽性細胞核的數(shù)量明顯增多，且TUNEL陽性細胞核的出現(xiàn)時間較肌萎縮早，懸吊第7天即可出現(xiàn)。TUNEL陽性細胞核包括形態(tài)正常的細胞核，在同一條纖維中也有TUNEL陰性的細胞核。應(yīng)用激素、IGF-1與訓(xùn)練治療后，凋亡細胞核數(shù)量減少，說明凋亡與肌細胞核丟失有關(guān)。Siu等將成年大鼠后肢懸吊14 d后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)側(cè)腓腸肌內(nèi)凋亡DNA碎片較正常對照組明顯增加，bax與bcl-2 mRNA的表達上調(diào)，胞漿內(nèi)細胞色素C的濃度增加，凋亡誘導(dǎo)因子AIF的表達也顯著上調(diào)。說明失負荷引起的骨骼肌萎縮，不僅可導(dǎo)致慢肌肌纖維的凋亡，也可引起快肌肌纖維的凋亡。Alway等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠后肢懸吊7、14、21 d后，骨骼肌中多聚腺苷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)陽性的細胞核(表示細胞凋亡)分別占22％、12％和10％，caspase水平增高，并伴分化抑制因子-2(Inhibitor ofdifferentiation-2，Id2)表達上調(diào)，尤其在懸吊7 d與14 d組。說明Id2可能參與骨骼肌纖維的凋亡，細胞凋亡具有時間依從性關(guān)系，肌纖維的凋亡可能是通過啟動線粒體途經(jīng)進行的。此外caspases的表達也上調(diào)，使PARP-Ⅰ裂解增多，引起懸吊骨骼肌PARP-1陽性細胞核數(shù)量增加，PARP-1可能通過凋亡啟始因子激活凋亡程序，失負荷肌內(nèi)caspase-8表達也上調(diào)，因此也可能活化死亡區(qū)域受體經(jīng)由TNF-α途經(jīng)激活細胞凋亡。
Leeuwenburgh等認為，骨骼肌萎縮與肌核的數(shù)量減少有關(guān)，而肌核的數(shù)量主要是通過凋亡途徑丟失的，并認為年齡與骨骼肌萎縮和肌纖維凋亡有關(guān)。隨年齡增加，比目魚肌纖維凋亡水平(TUNEL標記的陽性細胞核的數(shù)量與DNA碎片)明顯增高，caspase-3的活性趨于增加，核酸內(nèi)切酶G(endonuclease G，Endo G，一種線粒體特異核酸酶)存在核異位現(xiàn)象，但EndoG蛋白含量無改變。這導(dǎo)致肌核領(lǐng)域(即每個核的橫截面積)明顯減少，其中以老年動物為著。青壯年大鼠失負荷引起的比目魚肌萎縮與肌核數(shù)量丟失有關(guān)，而老年大鼠雖然其凋亡水平明顯增高，但肌萎縮與肌核數(shù)量丟失無關(guān)，這種現(xiàn)象有待于進一步研究。后肢懸吊14d后，青壯年組與老年組比目魚肌的凋亡水平均明顯增加，隨年齡增長而增加尤為顯著；青壯年組caspase-3的活性明顯增加，而老年組無明顯增加；老年組Endo G存在核異位現(xiàn)象，且EndoG蛋白含量明顯增加。表明老年骨骼肌肌核領(lǐng)域存在失調(diào)現(xiàn)象，在失負荷后這種現(xiàn)象尤其明顯。青壯年與老年骨骼肌纖維凋亡途徑不同，失負荷引起的青壯年骨骼肌萎縮是激活caspase相關(guān)機制導(dǎo)致肌纖維凋亡，而老年骨骼肌纖維的凋亡可能經(jīng)由與caspase無關(guān)的途徑，如EndoG異位。
二、脊髓損傷引起的肌纖維凋亡與骨骼肌萎縮
Dupont-Versteegden等將大鼠T-10水平脊髓橫斷，并在橫斷5 d后開始踏車訓(xùn)練5 d，取大鼠比目魚肌，發(fā)現(xiàn)脊髓橫斷組與訓(xùn)練組活化的肌衛(wèi)星細胞的數(shù)量增加，但訓(xùn)練組增殖的肌衛(wèi)星細胞并沒有融入肌纖維。脊髓橫斷5d后肌細胞核的數(shù)量下降25％，TUNEL陽性細胞核的數(shù)量增加，訓(xùn)練后凋亡細胞核的數(shù)量較橫斷組減少，但凋亡細胞核數(shù)量的減少并沒有導(dǎo)致肌細胞核的數(shù)量增加。表明細胞凋亡可能導(dǎo)致脊髓橫斷后骨骼肌萎縮肌細胞核的丟失；訓(xùn)練能夠使肌肉體積增大，但不能增加肌細胞核的數(shù)量。此外，他們在大鼠T-10水平脊髓橫斷后進行胚胎脊髓移植加訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)胚胎脊髓移植聯(lián)合訓(xùn)練能夠使比目魚肌的體積明顯增大，肌細胞核的數(shù)量較橫斷組有明顯恢復(fù)，肌細胞核數(shù)量增加可能與肌衛(wèi)星細胞增殖、分化、融入肌纖維有關(guān)。
三、制動引起的肌纖維凋亡與骨骼肌萎縮
Smith等將兔踝關(guān)節(jié)縮短位管型制動2d與6 d，發(fā)現(xiàn)比目魚肌顯著萎縮，肌肉濕重與橫截面積下降，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)肌纖維核染色質(zhì)濃縮，肌細胞核形態(tài)不規(guī)則，肌絲破壞，肌膜下線粒體異常。制動2d，TUNEL陽性細胞核的數(shù)量明顯增多，制動6 d減少，表明凋亡參與制動引起的慢肌萎縮。Jin等對兔后肢管型制動3、7、14、28 d，發(fā)現(xiàn)制動后萎縮骨骼肌內(nèi)有TUNEL陽性凋亡細胞，說明凋亡參與了制動引起的骨骼肌萎縮的過程。凋亡細胞的數(shù)量與制動時間相關(guān)，在制動14 d凋亡達高峰，且骨骼肌萎縮的程度與肌細胞凋亡的程度呈正相關(guān)。
四、失神經(jīng)支配引起的肌纖維凋亡與骨骼肌萎縮
失神經(jīng)支配后骨骼肌萎縮，肌纖維的體積與重量進行性減少。Borisov等研究證實，凋亡參與失神經(jīng)支配引起的肌萎縮與肌細胞核數(shù)量的丟失。從時間依從關(guān)系上研究發(fā)現(xiàn)，TUNEL陽性細胞核的出現(xiàn)先于骨骼肌的萎縮。Siu等認為，失神經(jīng)支配后骨骼肌萎縮可通過激活線粒體途經(jīng)啟動肌細胞凋亡。大鼠失神經(jīng)支配14 d，內(nèi)側(cè)腓腸肌內(nèi)TUNEL陽性細胞核的數(shù)量明顯增多，bax與bcl-2 mRNA表達上調(diào)，但bax/bcl-2比例明顯增加，細胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)、caspase-3、9等的表達也顯著上調(diào)，表明骨骼肌失神經(jīng)支配后線粒體途經(jīng)的凋亡信號因子上調(diào)，凋亡在調(diào)節(jié)失神經(jīng)支配的骨骼肌萎縮中起著重要作用。臨床研究較多的是進行性脊肌萎縮。超微結(jié)構(gòu)下觀察發(fā)現(xiàn)，肌纖維丟失的機制是凋亡，急性嬰兒型脊髓型肌萎縮患兒的肌纖維發(fā)生降解現(xiàn)象，TUNEL陽性細胞核的數(shù)量增多，伴有凋亡小體的形成以及鄰近肌纖維的吞噬作用。凋亡相關(guān)因子(如bcl-2、bax、caspase-1等)表達上調(diào)。凋亡發(fā)生時，同時激活了抗凋亡因子，但抗凋亡因子bcl-2表達上調(diào)不足以對抗bax的高表達，因此不能阻止凋亡細胞降解。Tews等對實驗性大鼠面肌失神經(jīng)支配與重支配模型的研究發(fā)現(xiàn)，失神經(jīng)支配骨骼肌凋亡細胞核的數(shù)量明顯增多，而重新支配的骨骼肌凋亡細胞核的數(shù)量明顯減少。幾乎所有失神經(jīng)支配的肌纖維都高水平表達bax，其中有25％的肌纖維(主要是萎縮的肌纖維)既表達bcl-2，又表達bcl-xl。神經(jīng)再支配的肌纖維，凋亡細胞核內(nèi)bax與bcl-2產(chǎn)物下降表現(xiàn)為時間依賴性。失神經(jīng)支配肌細胞核凋亡的機制可能也是氧化應(yīng)激導(dǎo)致肌纖維的變性與丟失。
總之，骨骼肌纖維是多核細胞，神經(jīng)肌肉電活動減低和/或負荷的減少導(dǎo)致骨骼肌纖維萎縮，肌纖維凋亡可能是骨骼肌萎縮、肌細胞核數(shù)量丟失的機制之一。后肢懸吊、脊髓損傷、制動、失神經(jīng)支配等引起的骨骼肌萎縮均與肌纖維凋亡有關(guān)：bax與bcl-2表達上調(diào)說明主要通過啟動線粒體途經(jīng)的凋亡引起肌萎縮與肌細胞核數(shù)量的減少。肌纖維凋亡的機制可能與氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧自由基、一氧化氮、過亞硝酸鹽等有關(guān)。
(修回日期：2007-02-25)
(本文編輯：松明)