范曉華紀樹榮周紅俊
《中華物理醫學與康復雜志》2007年07期
【作者單位】：山東省立醫院康復醫學中心；
北京博愛醫院；
骨骼肌纖維是多核纖維，肌核的轉錄活動和/或肌核的數量發生變化時，基因物質的含量可能發生改變，從而參與肌纖維蛋白含量與肌纖維體積的調節。神經肌肉電活動減低和/或負荷的減少(如脊髓損傷、后肢懸吊與太空飛行、制動、失神經支配等)可導致骨骼肌纖維發生顯著、快速的萎縮，并伴有細胞核的數量減少。肌核丟失的機制不明，可能與細胞凋亡有關。本文主要歸納肌纖維凋亡與骨骼肌萎縮的研究進展。
細胞凋亡在光鏡下不易區分。細胞凋亡分3個階段，即啟始階段、效應階段及降解階段。在啟始階段，細胞內或細胞外損傷與凋亡啟動刺激(如氧自由基產物或胞漿內鈣離子內流等)活化不同的途徑，啟動凋亡過程。促凋亡因子bax與抗凋亡因子bcl-2之間的失衡啟動線粒體途徑。效應階段又分為線粒體途經、內質網途經與死亡因子及其受體途經。在效應階段，線粒體膜的通透性增加引起促凋亡因子的釋放，如caspase活化因子(細胞色素C、hsp10)以及AIF。這些因子活化caspase水解級聯反應，導致降解階段典型的形態學特征。如細胞骨架的重排、DNA碎片、膜的發泡、凋亡小體的形成。細胞是否發生凋亡是由氧化應激水平決定的。
肌纖維凋亡概述
正常骨骼肌纖維呈細長圓柱形，有多個甚至幾百個橢圓形細胞核，細胞核位于細胞周緣。胞漿內含有許多與細胞長軸平行排列的肌原纖維，肌原纖維之間有大量的線粒體、糖原及少量脂滴，肌漿內還含有肌紅蛋白。快肌纖維細胞核的數量少于慢肌纖維。
骨骼肌在正常發育過程中，凋亡對肌細胞核的數量起重要的調節作用。包括人類在內的哺乳動物，在胎兒肌纖維發育早期，有40％以上的肌細胞是通過凋亡清除的，說明正常骨骼肌發育中也存在凋亡現象。出生后骨骼肌與成年骨骼肌纖維內，TUNEL陽性細胞核很少見，且沒有凋亡相關蛋白(如bcl-2家族或caspase家族)的表達，表明正常骨骼肌纖維的胞漿能夠抵抗細胞色素C-依賴的Ⅱ型caspase活化，且缺乏凋亡蛋白激酶活化蛋白-1(apoptosisproteasc activator protein-1，APAF-1)。
同一機體不同細胞譜系有不同的凋亡類型，因此多核肌纖維的凋亡，不同于單核細胞的凋亡。肌纖維內的一個細胞核控制相連的數個肌節，一條肌纖維中，同一時間內并非所有的核均表現為凋亡的DNA碎片，可能為單個肌細胞核的凋亡與相關肌節的降解，長此以往可導致肌纖維萎縮，如失神經支配后骨骼肌失去神經的營養作用、脊髓損傷后骨骼肌神經肌肉電活動與負荷均減少。
病理狀態下，肌纖維促凋亡蛋白bax、caspases與抗凋亡蛋白bcl-2的表達均明顯上調，說明肌纖維既能啟動線粒體途經的凋亡，又能啟動抗凋亡作用。Bax與bcl-2表達明顯上調，提示線粒體膜內轉變小孔的通透性增加是啟動肌纖維凋亡的主要原因，bax與bcl-2的失衡可能起著決定性作用。而促凋亡因子FAS的表達、caspases以及其后降解階段發生的過程與肌纖維凋亡的關系，目前尚不明了。神經肌肉疾病時(如失神經支配、肌營養不良、先天性肌病等)caspase表達上調，慢性心衰或燒傷時骨骼肌caspase表達也上調，尤其是caspase-3可能是參與凋亡肌纖維降解的重要因子。凋亡特定蛋白(apoptosis-pecific protein，ASP)也稱為c-Jun/AP-1，是凋亡降解階段的一個標記物，在肌纖維凋亡的降解階段表達明顯上調，見于有邊緣空泡的遠端肌病。目前不知ASP的表達僅與凋亡有關，還是與自噬作用形成的邊緣空泡有關。
目前尚不清楚降解的肌細胞核與相關收縮成分是如何清除的。Fidzianska等發現，在嬰兒型脊髓肌萎縮內，鄰近肌纖維吞噬凋亡小體包括降解的染色質與凋亡肌纖維的收縮成分。也有研究發現，凋亡的肌纖維是由巨噬細胞或通過自噬作用清除的，自噬作用與邊緣空泡的形成有關。此外，有研究發現，肌節的降解可能早于肌細胞核的降解，蛋白水解作用可能參與肌節的降解。
肌纖維凋亡的機制至今尚不明了，可能與氧化應激產生的氧自由基、一氧化氮、過亞硝酸鹽等有關，也可能與細胞漿內Ca2+濃度、TNF-α等因素有關。Leeuwenburgh和Adhihetty等認為，氧自由基的產生可促使線粒體釋放細胞色素C，活化caspase-9，進而激活caspase-3，啟動肌細胞核的凋亡。細胞漿內Ca2+濃度增高，可激活內質網途徑介導的凋亡通路。
肌纖維凋亡與骨骼肌萎縮
一、后肢懸吊引起的肌纖維凋亡
Allen等研究發現，大鼠后肢懸吊后，比目魚肌(慢肌)肌纖維TUNEL標記的陽性細胞核的數量明顯增多，且TUNEL陽性細胞核的出現時間較肌萎縮早，懸吊第7天即可出現。TUNEL陽性細胞核包括形態正常的細胞核，在同一條纖維中也有TUNEL陰性的細胞核。應用激素、IGF-1與訓練治療后，凋亡細胞核數量減少，說明凋亡與肌細胞核丟失有關。Siu等將成年大鼠后肢懸吊14 d后，發現內側腓腸肌內凋亡DNA碎片較正常對照組明顯增加，bax與bcl-2 mRNA的表達上調，胞漿內細胞色素C的濃度增加，凋亡誘導因子AIF的表達也顯著上調。說明失負荷引起的骨骼肌萎縮，不僅可導致慢肌肌纖維的凋亡，也可引起快肌肌纖維的凋亡。Alway等研究發現，大鼠后肢懸吊7、14、21 d后，骨骼肌中多聚腺苷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)陽性的細胞核(表示細胞凋亡)分別占22％、12％和10％，caspase水平增高，并伴分化抑制因子-2(Inhibitor ofdifferentiation-2，Id2)表達上調，尤其在懸吊7 d與14 d組。說明Id2可能參與骨骼肌纖維的凋亡，細胞凋亡具有時間依從性關系，肌纖維的凋亡可能是通過啟動線粒體途經進行的。此外caspases的表達也上調，使PARP-Ⅰ裂解增多，引起懸吊骨骼肌PARP-1陽性細胞核數量增加，PARP-1可能通過凋亡啟始因子激活凋亡程序，失負荷肌內caspase-8表達也上調，因此也可能活化死亡區域受體經由TNF-α途經激活細胞凋亡。
Leeuwenburgh等認為，骨骼肌萎縮與肌核的數量減少有關，而肌核的數量主要是通過凋亡途徑丟失的，并認為年齡與骨骼肌萎縮和肌纖維凋亡有關。隨年齡增加，比目魚肌纖維凋亡水平(TUNEL標記的陽性細胞核的數量與DNA碎片)明顯增高，caspase-3的活性趨于增加，核酸內切酶G(endonuclease G，Endo G，一種線粒體特異核酸酶)存在核異位現象，但EndoG蛋白含量無改變。這導致肌核領域(即每個核的橫截面積)明顯減少，其中以老年動物為著。青壯年大鼠失負荷引起的比目魚肌萎縮與肌核數量丟失有關，而老年大鼠雖然其凋亡水平明顯增高，但肌萎縮與肌核數量丟失無關，這種現象有待于進一步研究。后肢懸吊14d后，青壯年組與老年組比目魚肌的凋亡水平均明顯增加，隨年齡增長而增加尤為顯著；青壯年組caspase-3的活性明顯增加，而老年組無明顯增加；老年組Endo G存在核異位現象，且EndoG蛋白含量明顯增加。表明老年骨骼肌肌核領域存在失調現象，在失負荷后這種現象尤其明顯。青壯年與老年骨骼肌纖維凋亡途徑不同，失負荷引起的青壯年骨骼肌萎縮是激活caspase相關機制導致肌纖維凋亡，而老年骨骼肌纖維的凋亡可能經由與caspase無關的途徑，如EndoG異位。
二、脊髓損傷引起的肌纖維凋亡與骨骼肌萎縮
Dupont-Versteegden等將大鼠T-10水平脊髓橫斷，并在橫斷5 d后開始踏車訓練5 d，取大鼠比目魚肌，發現脊髓橫斷組與訓練組活化的肌衛星細胞的數量增加，但訓練組增殖的肌衛星細胞并沒有融入肌纖維。脊髓橫斷5d后肌細胞核的數量下降25％，TUNEL陽性細胞核的數量增加，訓練后凋亡細胞核的數量較橫斷組減少，但凋亡細胞核數量的減少并沒有導致肌細胞核的數量增加。表明細胞凋亡可能導致脊髓橫斷后骨骼肌萎縮肌細胞核的丟失；訓練能夠使肌肉體積增大，但不能增加肌細胞核的數量。此外，他們在大鼠T-10水平脊髓橫斷后進行胚胎脊髓移植加訓練，發現胚胎脊髓移植聯合訓練能夠使比目魚肌的體積明顯增大，肌細胞核的數量較橫斷組有明顯恢復，肌細胞核數量增加可能與肌衛星細胞增殖、分化、融入肌纖維有關。
三、制動引起的肌纖維凋亡與骨骼肌萎縮
Smith等將兔踝關節縮短位管型制動2d與6 d，發現比目魚肌顯著萎縮，肌肉濕重與橫截面積下降，電鏡觀察發現肌纖維核染色質濃縮，肌細胞核形態不規則，肌絲破壞，肌膜下線粒體異常。制動2d，TUNEL陽性細胞核的數量明顯增多，制動6 d減少，表明凋亡參與制動引起的慢肌萎縮。Jin等對兔后肢管型制動3、7、14、28 d，發現制動后萎縮骨骼肌內有TUNEL陽性凋亡細胞，說明凋亡參與了制動引起的骨骼肌萎縮的過程。凋亡細胞的數量與制動時間相關，在制動14 d凋亡達高峰，且骨骼肌萎縮的程度與肌細胞凋亡的程度呈正相關。
四、失神經支配引起的肌纖維凋亡與骨骼肌萎縮
失神經支配后骨骼肌萎縮，肌纖維的體積與重量進行性減少。Borisov等研究證實，凋亡參與失神經支配引起的肌萎縮與肌細胞核數量的丟失。從時間依從關系上研究發現，TUNEL陽性細胞核的出現先于骨骼肌的萎縮。Siu等認為，失神經支配后骨骼肌萎縮可通過激活線粒體途經啟動肌細胞凋亡。大鼠失神經支配14 d，內側腓腸肌內TUNEL陽性細胞核的數量明顯增多，bax與bcl-2 mRNA表達上調，但bax/bcl-2比例明顯增加，細胞色素C、凋亡誘導因子(AIF)、caspase-3、9等的表達也顯著上調，表明骨骼肌失神經支配后線粒體途經的凋亡信號因子上調，凋亡在調節失神經支配的骨骼肌萎縮中起著重要作用。臨床研究較多的是進行性脊肌萎縮。超微結構下觀察發現，肌纖維丟失的機制是凋亡，急性嬰兒型脊髓型肌萎縮患兒的肌纖維發生降解現象，TUNEL陽性細胞核的數量增多，伴有凋亡小體的形成以及鄰近肌纖維的吞噬作用。凋亡相關因子(如bcl-2、bax、caspase-1等)表達上調。凋亡發生時，同時激活了抗凋亡因子，但抗凋亡因子bcl-2表達上調不足以對抗bax的高表達，因此不能阻止凋亡細胞降解。Tews等對實驗性大鼠面肌失神經支配與重支配模型的研究發現，失神經支配骨骼肌凋亡細胞核的數量明顯增多，而重新支配的骨骼肌凋亡細胞核的數量明顯減少。幾乎所有失神經支配的肌纖維都高水平表達bax，其中有25％的肌纖維(主要是萎縮的肌纖維)既表達bcl-2，又表達bcl-xl。神經再支配的肌纖維，凋亡細胞核內bax與bcl-2產物下降表現為時間依賴性。失神經支配肌細胞核凋亡的機制可能也是氧化應激導致肌纖維的變性與丟失。
總之，骨骼肌纖維是多核細胞，神經肌肉電活動減低和/或負荷的減少導致骨骼肌纖維萎縮，肌纖維凋亡可能是骨骼肌萎縮、肌細胞核數量丟失的機制之一。后肢懸吊、脊髓損傷、制動、失神經支配等引起的骨骼肌萎縮均與肌纖維凋亡有關：bax與bcl-2表達上調說明主要通過啟動線粒體途經的凋亡引起肌萎縮與肌細胞核數量的減少。肌纖維凋亡的機制可能與氧化應激產生的氧自由基、一氧化氮、過亞硝酸鹽等有關。
(修回日期：2007-02-25)
(本文編輯：松明)