尚金星張梅趙自剛
《河北北方學院學報(醫學版)》2008年06期
【作者單位】：河北北方學院；河北北方學院病理生理學教研室；
【關鍵詞】缺氧；細胞凋亡；凋亡基因
細胞凋亡（apoptosis）是由體內外因素觸發細胞內預存的死亡程序而導致細胞死亡的過程。大量研究表明，心肌細胞的凋亡可能與組織中抗細胞凋亡基因與促凋亡基因的表達失衡有關，同時也可受細胞周圍的刺激信號所誘導或抑制。缺氧是因組織供氧減少或利用氧障礙引起細胞發生代謝、功能和形態結構異常變化的病理過程。研究顯示組織缺氧可誘發細胞凋亡，如復制心肌細胞缺氧模型中可觀察到偽足縮短或消失，緊密的星形心肌細胞變得疏松孤立，呈條索狀；細胞核發生斷裂，呈分葉、碎片狀，核膜完整包被形成凋亡小體；細胞質皺縮，核固縮、深染，染色質濃集等主要凋亡形態變化特征。同時，缺氧也可誘導體外培養的心肌細胞發生凋亡；李雅莉等認為神經元凋亡是腦缺血缺氧損傷的主要形式。探討缺氧致細胞凋亡的發生機制是臨床干預缺氧性損傷的基礎，本文綜述其發生機制。
1線粒體損傷
細胞內氧化磷酸化、能量代謝和抗活性氧化均有賴于線粒體的功能。研究表明，缺氧所致的細胞凋亡，均先表現為線粒體功能紊亂，尤其是線粒體跨膜電位(△ψm)的破壞。組織細胞缺氧時，細胞膜離子泵功能障礙，膜通透性增強，膜流動性下降，膜受體功能障礙導致Na+大量內流，胞內Na+濃度升高，可激活鈉泵增加Na+排出，從而消耗大量ATP，這又進一步增強線粒體氧化磷酸化過程。嚴重缺氧時，ATP生成減少，使鈉泵功能障礙，細胞內Na+增多，促進細胞內鈉水潴留，導致線粒體膜通透性增加，線粒體腫脹。當線粒體部位的PO2降到臨界點1mmHg時，可抑制線粒體內脫氫酶的功能，ATP生成進一步減少，呼吸鏈被破壞。
在凋亡過程中起重要作用的不僅是線粒體呼吸鏈活性的喪失，更重要的是細胞色素C（Cyt C）自線粒體的釋放。Cyt C是一種核編碼的蛋白質，分子量約14.5KU，位于線粒體內膜的呼吸鏈復合物Ⅲ和Ⅳ之間，在傳遞電子和ATP生成過程中起重要作用。生理情況下，線粒體內膜對物質通透具有高度選擇性，CytC很難從內膜進入胞質中。許多實驗結果顯示，細胞在各種有害因素如缺血缺氧、自由基生成增多、胞內鈣超載等刺激下，通過胞內信號轉導，或直接使線粒體結構受損，線粒體應激，使線粒體內外膜間的通透性轉換孔（permeability transition pore，PTP）開放，使凋亡啟動因子如呼吸鏈成分Cyt C自線粒體釋放入胞質中。CytC作為一種凋亡誘導蛋白可以激活其他凋亡蛋白的活化，其在細胞質中與半脘氨酸蛋白酶-9（caspase-9）酶原、凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptotic protease activationfactor-1，APAF-1）結合在一起形成一巨大的復合物，caspase-9得以激活，接著又激活了caspase-3，從而引導細胞進入了不可逆的“被刪除”階段。
線粒體改變引起細胞凋亡已知有5種機制：
①電子傳遞、氧化磷酸化和ATP產生的破壞；
②釋放激活caspases家族的蛋白，如Cyt C；
③改變細胞氧化還原潛能；
④細胞自發的受Bcl-2抑制的核固縮和DNA裂解依賴線粒體的存在；
⑤線粒體釋放的死亡因子還包括：AIF、Smac/D IABALOAIF、Endo-nuclease G。
2鈣超載
自從Kaiser等發現糖皮質激素誘導的胸腺細胞凋亡與Ca2+內流增加有關以來，越來越多的直接或間接證據表明胞漿Ca2+濃度上升是細胞凋亡的一個重要事件。Ca2+作為第二信使或死亡信號轉導分子，通過參與某些和細胞凋亡相關的蛋白激酶和核酸酶的活化介導細胞凋亡。缺氧時是導致Ca2+超載常見原因，其機制有：
①缺氧時，鈉泵功能受損，Na+離子大量內流，細胞內Na+明顯升高，Na+/Ca2+交換蛋白以反向轉運的方式將細胞內排出、Ca2+進入細胞；
②缺氧時，細胞膜嚴重受損，對Ca2+的通透性大大增加；
③缺氧時產生大量氧自由基，自由基可以造成肌漿網膜損傷，鈣泵功能抑制，使肌漿網攝Ca2+減少，胞漿濃度升高；
④線粒體膜損傷抑制氧化磷酸化過程，使ATP生成減少，細胞膜和肌漿網攝鈣能量供應不足，促進鈣超載的發生。
鈣超載被認為是導致凋亡的重要因素，其主要機制有：
①激活與凋亡有關的各種酶，包括激活鈣依賴性核酸內切酶使DNA降解，導致細胞凋亡；
②激活誘生型一氧化氮合酶，引起NO合成增加，高濃度的NO使DNA中嘌呤和嘧啶脫氨基，引起突變和DNA鏈斷裂；同時NO可降低胞漿的pH，并抑制蛋白質和核酸的合成；NO還增加p53表達及減少細胞ATP合成，NO的這些細胞毒性可導致細胞凋亡；
③激活谷氨酰胺轉移酶，催化細胞內肽鏈間的酰基轉移，在肽鍵間形成共價鍵，使細胞骨架蛋白分子間發生廣泛交聯，有利于凋亡小體的形成；
④激活核轉錄因子NF-κB，加速細胞凋亡相關基因的轉錄；
⑤Ca2+在ATP的配合下使DNA鏈舒展，暴露出核小體之間的連接區內的酶切位點，有利于DNA核酸內切酶切割DNA。
3自由基損傷
在誘發細胞凋亡的諸多因素中，內源性或外源性因素產生的自由基增多均被證實可誘導細胞凋亡。Tory等通過特異性抑制PC12神經細胞系中Cu-Zn-SOD合成，證明SOD活力下降可導致細胞凋亡，這種凋亡是氧自由基誘導的。Lennon等對4種不同造血細胞HL60、U937、Molt-4和Daudi進行體外培養，發現活性氧（reactive oxygen species，ROS）直接引起細胞凋亡。劉戎等證實ROS可誘導細胞凋亡，抗氧化劑可阻斷細胞凋亡的發生。缺氧導致的細胞內Ca2+濃度增加，可以增強Ca2+依賴性蛋白激酶的活性，促進自由基的生成，還可以協同其他因素（如GSH下降）引發線粒體大量產生ROS。氧自由基化學性質活潑，破壞機體正常的氧化/還原的動態平衡，造成生物大分子（核酸、蛋白質、脂質）的氧化損傷，干擾正常的生命活動，形成嚴重的氧化應激（oxidative stress）狀態，機體氧化損傷的后果之一就是誘導細胞凋亡。
自由基可以通過以下途徑導致細胞凋亡：
①氧自由基引起的DNA損傷可激活p53基因；
②氧自由基引起的DNA損傷可活化多聚ADP核酸合成酶，引起NAD快速耗竭，ATP大量消耗；
③氧自由基攻擊細胞膜上的不飽和脂肪酸，通過脂質過氧化作用直接造成細胞膜的損傷；細胞膜中不飽和脂肪酸（如：花生四烯酸）的氧化產物過氧羥基24碳四烯酸可誘發細胞凋亡；
④氧化應激激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內切酶，也可以產生膜的發泡現象；
⑤氧化應激引起細胞膜的結構破壞，可改變細胞膜的通透性使Ca2+內流增加；
⑥自由基對線粒體膜的損害導致其通透性和膜電位改變；
⑦氧化應激可活化轉錄因子NF-κB、AP-1，加速細胞凋亡相關的一些基因表達；
⑧氧自由基通過影響某些酶活性蛋白質的活性，誘發細胞凋亡。
4低氧誘導因子-1與p53
近年的研究顯示嚴重或持續缺氧時，缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）可誘導細胞凋亡，Helton等在成年大鼠腦缺氧研究中，發現敲除大腦HIF-1α基因后可引起凋亡基因表達水平下降，從而減少大腦細胞發生凋亡。HIF-1是細胞及組織缺氧情況下產生的一種氧依賴的轉錄激活因子，廣泛存在于哺乳動物體內，能誘導多種缺氧反應性表達，使細胞及組織產生一系列反應以適應缺氧環境。HIF-1為缺氧應答的全局性調控因子，在缺氧誘導的哺乳動物細胞中廣泛表達，對缺氧具有特異感受性，參與體內許多缺氧反應性基因的轉錄調節，在低氧性肺損傷介導的細胞凋亡中有著重要的作用。HIF是由α和β亞基組成的異二聚體，α亞基表達受低氧誘導，β亞基則屬構建型表達。序列同源性α亞基目前認為有三種：HIF-1α、HIF-2α（也稱為EPAS1、MOP2、HLF、HRF）、HIF-3α，三者均受氧調節，是調節HIF活性的功能亞單位，三者在結構和功能上有許多相似之處。而β亞基不受調節細胞周期基因p53、p21、Bcl-2蛋白的調節，常氧時，HIF-1α通過泛素-蛋白溶解酶體通路降解而幾乎檢測不到，因其t1/2很短（約5min）。但細胞低氧時（如1%氧濃度）其t1/2增加到約30min。HIF-1調節的基因涉及細胞能量代謝、離子代謝、兒茶酚胺代謝及血管的發生，其介導轉錄的基因包括：促紅細胞生成素（Epo）、血管內皮生長因子（VEGF）、葡萄糖轉運蛋白1和3、血紅素氧化酶l、運鐵蛋白、轉鐵蛋白受體基因及編碼p53、p21、Bcl-2的基因。
缺氧可能是p53常見的生理誘導因素。研究發現體內缺氧誘導的凋亡所必需的p53能抑制HIF-1α轉錄激活。p53蛋白是一種定位于細胞核的磷蛋白，能夠促進細胞的終末分化和細胞凋亡，機體各組織均有p53表達，但快速的代謝轉換使正常細胞的p53蛋白量維持于低水平。除了與凋亡密切相關，p53還被證實是一種轉錄因子，介導下游基因的轉錄。相關實驗證實，低氧能增加神經細胞、心肌細胞、腫瘤細胞等的凋亡以及凋亡相關因子p53，Bax表達的顯著變化。國外有學者認為，低氧環境下產生兩種形式的p53，即野生型p53和突變型p53，分別在細胞凋亡和血管生長過程中發揮重要作用。有學者證實缺氧可誘導野生型胚胎干細胞p53的表達，但在HIF-1α基因缺陷的胚胎干細胞中，p53蛋白水平則沒有明顯變化，從而推測缺氧時p53蛋白水平的升高是HIF-1α依賴性的。并證實HIF-1α是通過直接結合p53，增加后者穩定性，從而促進細胞發生凋亡。但Chen D在體外實驗發現HIF-1α不能直接結合p53，而是直接與起橋梁作用的p53泛素連接酶Mdm2結合，HIF-1α通過抑制Mdm2介導的p53降解并阻止Mdm2介導的p53核轉移，增加p53穩定性。活化的p53進入核內，通過調控其下游基因p21/Waf1/Cip1和bax的表達，啟動相應的細胞信號途徑，或通過誘導線粒體通透性改變而直接轉位至線粒體，引起細胞周期停滯，啟動細胞凋亡程序。
5 Fas/Fas L
Fas蛋白是細胞膜上的跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體家族，由胞外外結合區、跨膜區及胞漿內區域構成。作為一個膜受體，Fas蛋白可以和T淋巴細胞表面的配體結合，也可以與抗Fas的抗體結合，從而啟動細胞凋亡。Fas蛋白介導細胞凋亡的機制可能有：
①Fas L或抗Fas的抗體與Fas蛋白結合，引起神經鞘磷脂酶的活性迅速上升，使神經鞘磷脂分解產生神經酰胺，神經酰胺作為第二信使激活相應的蛋白激酶，從而誘導細胞凋亡。
②抗Fas抗體或腫瘤壞死因子與Fas蛋白結合后可以激活ICE（IL-1βconverting enzyme）樣的caspase，后者可以降解H1組蛋白，使染色體松弛，DNA鏈舒展，而暴露出核酸內切酶的酶切位點，使DNA鏈更容易被切割。
③Fas蛋白激活后也可以通過Ca2+信號傳遞死亡信息而導致細胞凋亡。此外，近年來研究發現，在FAS/FASL誘導的細胞凋亡過程中，FAS和FAS L交聯能夠引起細胞內ROS含量增加和細胞氧化還原狀態的改變。Suzuki等用化學熒光指示劑Chemluminescence（該指示劑能與包括O2-、OH、單線氧等各種ROS反應）觀察B淋巴瘤細胞株BJAB和Ramos以及T淋巴細胞性白血病細胞株Jurkat在Fas/Fas L交聯后胞內ROS含量變化，發現Fas/Fas L交聯引起細胞內特異性ROS迅速產生，因此，Fas/Fas L還可以通過自由基的作用導致細胞凋亡。
總之，缺氧是許多疾病發展過程中一個重要的病理過程，細胞凋亡是缺氧損傷的重要形式，缺氧可通過線粒體損傷、Ca2+超載、自由基、HIF-1、p53、Fas/Fas L等多種途徑導致細胞凋亡。