高榮敏馬慧萍范小飛賈正平
《醫學綜述》2013年07期
【作者單位】：蘭州軍區蘭州總醫院藥劑科全軍高原環境損傷防治防治重點實驗室；
蘭州大學藥學院；
【摘要】：
細胞自噬是細胞依賴溶酶體的分解代謝過程，能降解受損蛋白、衰老或損傷的細胞器等細胞結構，可被多種應激所觸發。在營養匱乏或組織缺血缺氧等應激條件下，自噬作為相應的代謝過程通過提供代用能源及清除功能異常的細胞器及蛋白質類維持細胞存活。缺血缺氧是細胞自噬激活的重要誘因之一，自噬的適度增強可促進細胞在缺血缺氧等狀態下的存活。該文就細胞自噬的分子機制、缺血缺氧狀態下自噬調控通路的調節機制及其分子水平檢測技術的研究進展予以綜述。
細胞自噬是細胞依賴溶酶體的分解代謝過程，據底物進入溶酶體的方式不同，自噬分為巨自噬、微自噬及分子伴侶介導的自噬三種。巨自噬，即由內質網來源的膜包繞待降解物形成自噬體，然后與溶酶體融合并降解其內容物。微自噬指溶酶體或者液泡內膜直接內陷將底物包裹并降解的過程。分子伴侶介導的自噬是指胞質內蛋白先結合到分子伴侶后被轉運到溶酶體腔中，然后被溶酶體酶消化的過程，并且由組成型表達的熱休克蛋白70作為分子伴侶參與細胞自噬，且需要關鍵性因子溶酶體締合性膜蛋白2A(lysosomal-associated membrane protein type 2A，LAMP-2A)。
自噬在臨床上的應用愈來愈廣，長期以來自噬被認為有助于缺血缺氧狀態下細胞的存活。通過自噬標志物發現，哺乳動物細胞缺氧或再灌注缺血時細胞自噬水平增加。近期研究發現，自噬可以維持基礎狀態下心肌細胞的結構和功能，并在心肌缺血時保護心臟。
1細胞自噬分子機制
正常生理狀態下，自噬維持基礎水平，但是當出現營養匱乏，氧化應激等狀況時，自噬水平會升高。目前將與細胞自噬相關的特異性基因統一命名為autophagy-related gene(Atg)。自噬過程從形態學上劃分為三個階段：自噬誘導階段、自噬體的形成階段、自噬體的成熟及其內容物的降解階段。
1．1自噬誘導階段
自噬誘導階段關鍵性因子是Atg1(酵母中)或其同源物Ulk1(哺乳動物中)復合物、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)hVPS34-Atg6（Beclin 1)復合物和Atg14(complexⅠ)及其他相關元件。Atg1/Ulk 1復合物受到雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的調控。mTOR有mTORC1和mTORC2兩種不同的復合體，其中mTORC1在調控自噬方面起主要作用。在哺乳動物體內，當能量充足時，mTORC1被激活，結合Ulk1-Atg13-FIP200-Atg101復合體，從而抑制自噬。當細胞接受到饑餓信號時，mTORC1失活，與Ulk1-Atg13-FIP200-Atg101蛋白復合體分離，Ulk1被激活，進而導致Atg13、FIF200及Atg101的磷酸化，整個蛋白復合體構象發生改變，從而誘導細胞自噬。
1．2自噬體的形成階段
自噬過程被誘導后，由mVps34復合物Atg14-Vps15-mVps34啟動膜泡的成核反應，然后Atg21和Atg24結合到膜上，形成前自噬體，而后膜泡擴張將底物包繞，形成自噬體。哺乳動物中，Ulk1復合物結合PI3KhVPS34復合物和其產物三磷酸肌醇及蛋白質/脂質復合體PI3-phosphate(PI3P)連同PI3P的效應蛋白導致自噬吞噬體的形成。吞噬泡的延伸及自噬吞噬體的閉合需要Atg9和Atg8(哺乳動物中代表了Atg8蛋白家族：LC3A、LC3B、LC3C、GABARAP、GABARAPL1和GABARAPL2/GATE16)，其中Atg9是自噬體形成過程中參與的膜整合蛋白，Atg9的多聚化促進了自噬體膜的形成。LC3家族蛋白的C末端與Atg12-Atg5-Atg16L復合體相結合，該復合體參與自噬體的形成(Atg12先由泛素連接酶活化后與Atg5形成復合體，Atg5-Atg12進而與含有coiled-coil結構域蛋白Atg16結合形成多亞基蛋白復合體)。Atg8蛋白參與吞噬泡膜的延伸、閉合并形成雙重膜的自噬吞噬體的過程。
1．3自噬體的成熟及其內容物的降解階段
自噬體和溶酶體融合后，自噬體內包裹的核糖體、蛋白質聚集體、線粒體等成分將被溶酶體內的多種水解酶降解，某些降解后的產物，如氨基酸、脂肪酸等會重新參與到新陳代謝中去。近期研究發現哺乳動物細胞中，分子伴侶介導的自噬中自噬體與溶酶體融合過程需要LAMP-2A這一關鍵性分子。
2缺血缺氧狀態下自噬調控通路的調節機制
細胞自噬的調節與多個通路多個因子有關，目前研究比較透徹的是Bcl-2蛋白家族、mTOR通路、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase，AMPK)通路和p53通路（圖1）。下面將對各個通路及缺血缺氧狀態下各通路相關分子機制進行概述。
2．1 Bcl-2蛋白家族
Bcl-2蛋白家族是與細胞凋亡相關的基因家族，研究發現該家族與細胞自噬有密切關系，對細胞自噬具雙重作用。其中，抑制凋亡的Bcl-2、Bcl-x、Bcl-xL及Mcl-1等蛋白促進自噬，而促凋亡蛋白。Bax、Bad、Bcl-x等卻可以促進自噬的發生。研究發現，Beclin-1為自噬調控基因，包含4個結構域：BH3、螺旋-螺旋結構域、進化保守結構域及輸出結構域。
Bcl-2通過與Beclin-1的BH3結合，抑制細胞自噬，饑餓處理后JNK1被激活，磷酸化Bcl-2，Bcl-2-Beclin-1復合物解離，游離出Beclin-1，形成Beclin1-hVPS34-PI3K復合體，從而促進自噬。
mVps34、UVRAG及Bif-1等因子則通過與Beclin-1的不同結構域結合并相互作用上調自噬水平。研究發現，mVps34可與Beclin-1的螺旋-螺旋結構域和進化保守結構域結合，促進自噬；UVRAG可與Beclin-1的螺旋—螺旋結構域結合，上調自噬水平；Bif-1則通過UVRAG-Beclin-1復合物來激活mVps34，進而促進自噬。
2．2 mTOR通路
mTOR是一種在進化上較為保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇激酶相關蛋白激酶的家族成員，其在調節細胞生長、增殖、凋亡、自噬等方面具有重要作用。
研究發現，mTOR存在兩種不同的復合物形式：對雷帕霉素敏感的mTORC1包括mTOR、raptor（regulatory-associatedprotein of roTOR)、mLST8(mammalianortholog of LST8)、PRAS40(proline-richAkt substrate of 40kDa)，主要調節細胞生長、細胞凋亡、能量代謝和細胞自噬；對雷帕霉素不敏感的mTORC2包括mTOR、mLST8、rictor（rapamycininsensi tive companion of mTOR)、mSIN1(mitogen-activated protein kinase-associated protein 1)，主要與細胞骨架重組和細胞存活有關。其中，mTORC1在調控自噬方面起主要作用。
當細胞缺氧時，可通過REDD1(regulated indevelopment and DNA damage 1)蛋白激活復合型結節性硬化1/2(tuberous sclerosis complex 1/2，TSC 1/2)復合物，繼而抑制了RHEB，終抑制mTORC1，激活細胞自噬。TSC1/TSC2異二聚體能夠接受Akt等上游激酶信號。酪氨酸激酶受體(tyrosine kinasereceptor，RTK)接受上游生長因子的信號后自體磷酸化激活，進而激活兩條關鍵通路：PI3K-I通路與Ras通路。酪氨酸激酶受體激活PI3K-I通路后，促使磷酸肌醇依賴性蛋白激酶激活Akt，繼而抑制下游蛋白復合體TSC1/TSC2，激活mTORC1，抑制細胞自噬。Ras通路激活后，可激活PI3K-Akt-mTORC1通路而抑制自噬，也可通過Raf-1-MEK1/2-ERK1/2通路激活自噬。
當營養缺乏或雷帕霉素刺激時，TORC1活性受抑制，誘導細胞自噬的發生，這一進程需要Atg相關蛋白。Atg1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是該階段關鍵的蛋白，它通過與Atg13-Atg17復合物的相互作用增強自身酶活性，誘導細胞自噬；mTORC1可通過raptor與ULK1的作用磷酸化ULK1和mAtg13，抑制ULK1的活性，下調細胞自噬。當葡萄糖饑餓時，AMPK激活，mTORC1活性受抑制，后者對ULK1 Ser757位點的磷酸化減弱。AMPK通過增強對ULK1 Ser317位點和Ser777位點的磷酸化，激活ULK1，誘導細胞自噬。
2．3 AMPK通路
AMPK是能量代謝變化的感受器，在能量代謝過程中起重要的調節作用(圖2)。當細胞發生葡萄糖饑餓時，ATP/AMP的比例下降，從而激活AMPK。AMPK能磷酸化激活TSC1/2復合物。TSC2具有GTP酶活性，磷酸化激活后的TSC2對小GTP酶Rheb(Ras homolog enriched in brain)起抑制作用，而Rheb是激活mTORC1所必需的，所以通過加強對mTORC1的抑制作用，從而上調細胞自噬。研究發現AMPK可以直接磷酸化raptor，進而抑制mTORC1的活性。Decuypere等發現，胞內游離Ca2+的濃度升高可以激活Ca2+/CaMKKβ和TAK1通路，從而激活AMPK，自噬得以誘導發生。
缺血缺氧狀態下，細胞發生葡萄糖饑餓，AMPK可通過直接磷酸化ULK1 Ser317位點和Ser777位點激活ULK1，誘導細胞自噬。mTORC1可通過磷酸化ULK1 Ser757位點從而抑制ULK1的活性，激活AMPK，mTORC1受到抑制，故mTORC1磷酸化ULK1Ser757位點的作用減弱，從而激活自噬。研究證明，細胞缺乏營養時，ULK1Sm638位點和Ser758位點先后去磷酸化，進而可以解除AMPK與ULK1間的相互作用，從而激活ULK1，激活細胞自噬。
2．4 p53通路
p53是一種抑癌基因，對自噬的調控具有雙重作用。在細胞質中，p53能抑制細胞自噬，但在細胞核中，p53能上調自噬水平。研究發現，死亡相關蛋白激酶也是細胞自噬的重要調節因子，能激活p53，進而激活AMPK，上調自噬。另外，Bcl-2家族促凋亡蛋白Bax、Bad等也能被p53反式激活，使Beclin-1-Bcl-2復合物得以解離，上調細胞自噬。
3缺血缺氧狀態下細胞自噬分子水平的檢測技術
缺血缺氧是自噬激活的重要誘因之一。在營養匱乏或組織缺血缺氧等應激條件下，自噬作為相適應的代謝過程通過提供代用能源及清除功能異常的細胞器及蛋白質類維持細胞存活。可以通過檢測自噬過程所必需的蛋白分子的表達來檢測缺血缺氧下細胞白噬的活動水平。
3．1微管相關蛋白1輕鏈免疫印跡染色
微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1light ehain3，LC3)是酵母Atgs的同源體，是自噬體膜上的標志性蛋白質。LC3包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種存在形式，自噬水平升高時，LC3-Ⅰ表達水平下降，而LC3-Ⅱ表達增強，所以兩者的表達比值可作為細胞自噬水平的重要指標，其比值下降提示自噬活性減弱；反之則說明自噬活性增強。可采用免疫印跡和免疫沉淀法檢測LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達，而后通過兩者的表達比值來檢測自噬水平。
3．2 GFP-LC3基因轉染
GFP-LC3融合蛋白標志物的表達一度被廣泛地用于檢測細胞自噬水平。有學者研究出了tfLC3(tandem fluorescent-tagged LC3)、GFP-LC3和RFP-LC3在自噬體和自噬前體共表達，呈黃色，溶酶體和自噬體融合形成自噬溶酶體后，GFP信號消失，而RFP可耐受降解，所以RFP信號仍在(紅色)，因此可作為自噬溶酶體形成的標志。
3．3 p62-SQSTM1疫印跡染色
p62-SQSTM1通過與泛素化蛋白復合物相互作用，進而參與形成自噬吞噬體，激活自噬。研究發現p62在自噬性溶酶體內會被降解，故p62-SQSTM1免疫印跡常作為檢測細胞自噬水平的可靠指標，近來研究表明抑制自噬后，p62的表達增加。
3．4 LAMP-2A免疫染色
分子伴侶介導的自噬需要關鍵性因子LAMP-2A。研究發現，缺血缺氧等應激狀態能顯著上調LAMP-2A在mRNA及蛋白的表達水平，因此可以進行LAMP-2A的免疫染色和(或)熱休克蛋白70雙染色來檢測細胞自噬水平。
3．5 Beclin免疫染色
哺乳動物細胞中，Bcl-2家族對自噬的調控也發揮雙重作用。Beclin-1是酵母Atg6的同源體，可調控自噬體的生成，故其表達增強可作為自噬水平增強的重要指標。
4展望
細胞自噬作為一種基本的生命現象，與許多人類疾病包括癌癥、肌病及神經退行性疾病等密切相關，并且還與病原體清除率及抗原呈遞相關。缺血缺氧是細胞自噬激活的重要誘因之一，然而自噬與缺血缺氧后導致的疾病間的關系研究尚處于起步階段，缺血缺氧后自噬的分子機制、所涉及的調控因子及自噬水平的檢測，尚需要進一步的研究，從而有助于發現利用自噬治療缺血缺氧性相關疾病的新策略。