尤壽江石際俊張艷林劉春風
《中國病理生理雜志》2011年01期
【作者單位】：蘇州大學附屬第二醫院神經內科；
蘇州大學神經科學研究所衰老與神經疾病實驗室；
傳統觀念認為，活性氧類(reactive oxygen species，ROS)只是一類損傷細胞的毒性物質，近年的研究發現ROS作為一種信號分子參與細胞的增殖、分化及凋亡等多個生理過程。自噬是一種溶酶體依賴性的細胞內大分子物質和細胞器的降解過程，不僅在生理情況下發揮重要作用且參與一些疾病的發生發展。新的研究表明ROS，特別是線粒體源性ROS，作為信號分子參與自噬的調節。本文集中討論了ROS和自噬的關系以及ROS介導的自噬在疾病發生發展中的作用，從而為疾病的治療提供新的靶點和策略。
1 ROS和氧化應激
ROS是生物體有氧代謝產生的一類活性含氧化合物的總稱，包括超氧陰離子(O2·-)、自由基(超氧化物、羥基自由基)和過氧化物(過氧化氫，H2O2)等。這些物質可來源于生物分子的電離輻射、體內一些酶如NADPH氧化酶(NOX)和雙重氧化酶(DUOX)等的合成，同時線粒體在正常氧化呼吸時也會產生少量的ROS，如超氧化物及H2O2。在生理狀態下，胞內的生長因子、細胞因子及鈣信號參與了ROS產生的調節，低水平的ROS通常能夠被一些抗氧化的酶或物質降解，如谷胱甘肽(胞內氧化還原的主要緩沖物質)、硫氧蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶、過氧化物酶等。所以ROS產生和降解平衡的維持對于細胞發揮正常生理功能具有非常重要的意義。
如果胞內抗氧化物質不能夠有效降解ROS，就使得ROS在胞內蓄積從而引起氧化應激。蓄積的ROS氧化胞內的DNA、蛋白、脂質及細胞器。被ROS氧化的蛋白及脂質不僅失去應有的功能而且易于在胞內聚集，形成脂褐素等毒性物質，并通過影響溶酶體的活性而引起細胞死亡引。另外，氧化應激也引起線粒體的嚴重損害，線粒體內積聚的ROS可以使其DNA突變、脂質過氧化以及線粒體膜通道的開放，從而影響線粒體的功能。氧化導致的線粒體膜滲透性通道的開放導致線粒體膜的通透性增加，引起線粒體內ATP及Ca2+含量下降，致使線粒體腫脹及細胞色素C的釋放。研究認為線粒體此種嚴重的損害可以引起自噬、自噬性細胞死亡、凋亡和壞死。
2自噬
自噬是生物體通過溶酶體或囊泡降解胞內成分的總稱，不但在細胞的分化和成熟過程中起重要作用，而且在應對各種應激時也發揮著關鍵作用。
自噬主要有3種形式：大自噬(macroautophagy)即所謂的自噬、小自噬(microautophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。大自噬通過雙層膜結構包裹胞漿內物質，如蛋白及細胞器，形成自噬囊泡，自噬體的外膜或者液泡膜與溶酶體膜融合形成自噬溶酶體，溶酶體內的水解酶降解其包裹的底物。小自噬是溶酶體膜通過內吞作用直接包裹胞漿內物質。CMA途徑只能選擇性降解帶有特定信號基序賴-苯丙-谷-精-谷氨酰胺序列(KFERQ)的胞漿蛋白，胞漿內的伴侶蛋白特異性地識別這種信號基序然后與溶酶體膜上的受體溶酶體結合性膜蛋白2a(lysosome-associated membrane protein 2a，Lamp2a)結合從而將底物轉運到溶酶體內降解。
盡管，自噬起初被認為是非選擇性的降解過程，但目前的研究認為自噬可以通過優先降解胞內過多的細胞器即選擇性自噬，如過氧物酶體自噬（pexophagy)、內質網自噬(reticulophagy）和線粒體自噬(mitophagy）等，從而在機體應對各種應激過程中發揮重要作用。其中和氧化十分密切的是線粒體自噬。
3自噬在機體應對氧化應激過程中的雙重作用
近年，自噬既可以保護細胞又可以引起細胞死亡的雙重作用已被人們廣泛接受。同樣，在氧化應激時自噬也發揮著雙重作用。在應對氧化應激損傷時，機體會產生多種防御機制：上調抗氧化劑的水平、通過泛素蛋白酶體系統來降解特定的蛋白、通過自噬來降解已損傷的蛋白和細胞器。
一方面自噬的優先激活通過清除氧化的蛋白及損傷的細胞器而有利于細胞的存活。過多的ROS及其它物質可以通過優先激活線粒體自噬選擇性地降解氧化損傷的線粒體，從而減輕其對細胞的損害。過多的ROS可以誘導及加強CMA途徑對氧化蛋白的清除，因為氧化的蛋白相比未氧化的蛋白更易通過分子伴侶轉運到溶酶體內，而且在較弱的氧化應激情況下溶酶體更易結合及轉運CMA底物蛋白，從而有利于細胞存活。同樣自噬在清除正常衰老細胞中過多氧化的蛋白發揮重要作用，但隨著年齡的增長自噬的活性下降，不能夠有效地清除氧化的蛋白，導致衰老及一些老年性疾病，如阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)、糖尿病等的發生。
另一方面自噬可以直接誘導被氧化細胞的死亡。以往的研究認為，在氧化應激較強時，凋亡和壞死的機制就會被激活從而誘導細胞死亡。
4 ROS在自噬激活中的作用
4．1 ROS作為一個信號分子參與細胞的自噬性死亡
ROS作為一種胞內信號分子參與胞內許多生物過程，參與細胞增殖、凋亡、免疫及抗微生物過程。在神經生長因子（nerve growth factor，NGF)缺乏情況下，ROS初次被證實作為一種信號分子參與神經細胞的自噬性細胞死亡(autophagiecell death，ACD)。NGF的缺陷導致大量ROS在神經元線粒體內蓄積，ROS通過引起線粒體膜脂質過氧化，線粒體功能異常，終引起自噬性細胞死亡。通過敲除自噬關鍵基因beclin 1和自噬相關蛋白7(Atg7)，發現NGF缺陷導致細胞死亡減少，進一步明確自噬參與其中，且證明H2O2是誘導這種自噬性死亡有效而且必需的。應用抑制線粒體氧化呼吸鏈的藥物如魚藤酮可以使線粒體內產生過多的ROS引起自噬性細胞死亡。以上研究表明ROS作為信號分子通過誘導自噬參與了細胞的死亡。目前還并不清楚具體參與這些白噬性細胞死亡的ROS，但有學者認為可能有多種ROS同時參與其中，如O2·-和H2O2。
研究發現自噬的激活又可以加劇ROS的蓄積。Caspase抑制劑可以導致自噬選擇性地優先降解過氧化氫酶，導致線粒細胞內ROS蓄積并終引起細胞死亡。通過ROS蓄積和自噬之間反饋環路的假說可以解釋這一現象：低水平的ROS激活自噬，自噬的激活降解過氧化氫酶反過來又可以增加H2O2的水平，H2O2的增加進一步激活自噬。這些結果表明，過氧化氫酶的降解或許導致H2O2信號的延長，在自噬性存活向自噬性死亡轉化過程中起重要作用。
4．2 ROS參與細胞的自噬性存活
近期的研究發現ROS也參與饑餓誘導自噬的調節，而這種自噬的激活有利于細胞的存活。在饑餓時，通過Ⅲ型PI3K-mTOR途徑引起線粒體內H2O2蓄積從而激活自噬。
饑餓誘導的氧化信號在饑餓的早期就會出現，H2O2通過氧化底物自噬相關蛋白4(Atg4)發揮作用。Atg4是自噬途徑中重要的蛋白之一，其功能是切割泛素樣蛋白家族自噬相關蛋白8(Atg8)蛋白的c末端，Atg8是一個與自噬溶酶體膜上的磷脂酰乙醇胺結合的重要的物質。Atg4只能切割與溶酶體膜共價結合的Atg8，切割形成的游離的Atg8在胞漿中可以循環利用。而氧化的Atg4則不能夠切割與溶酶體膜共價結合的Atg8從而誘導自噬的激活。在這個過程中Atg4是ROS誘導自噬性細胞存活信號通路中的一個中間物質。進一步的研究認為H2O2相比其它ROS信號更有優勢：H2O2相對穩定，壽命長及作為一種中性離子更易通過線粒體膜。然而，仍然不清楚的是在這條途徑中Atg4是否是H2O2的僅有底物?Atg4的抑制僅存在于饑餓誘導的自噬還是存在于所有的白噬途徑中?
既然ROS參與了自噬的調節，那么ROS信號的來源是什么呢?目前的研究認為參與自噬調節的ROS主要來源于線粒體。ROS的產生和降解之間平衡的破壞是線粒體內ROS聚集的主要原因。大量研究表明，線粒體產生的ROS可以誘導自噬：
(1)應用rotenone、4，4，4-三氟-1-[2-噻吩]-1-3-丁烷二酮（thenoyltrifluomacetone，TTFA)、H2O2或2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)等抑制線粒體膜的呼吸鏈復合體可以誘導線粒體內ROS蓄積，從而引起細胞的自噬性死亡；
(2)雷帕霉素和神經生長因子（nervegrowth factor，NGF)缺乏使得線粒體膜脂質氧化從而上調自噬；
(3)營養缺陷誘導ROS蓄積所致的自噬激活也與線粒體密切相關。
因此，我們推測線粒體可以作為誘導自噬的氧化還原信號的來源。
4．3線粒體在自噬體形成中的作用
線粒體可以通過產生ROS調節自噬體的形成，然而其對自噬的調節是否只能通過ROS產物起作用呢?有研究顯示，在酵母中自噬相關蛋白9(Atg9)(與自噬相關的兩個胞膜內蛋白之一)在前自噬溶酶體結構及其周圍結構之間循環，這表明自噬體形成過程中存在膜成分的循環利用；同時位于周圍的Atg9活性結構存在于線粒體附近。已明確哺乳動物細胞內的兩個Atg9亞型且這兩個亞型都參與自噬溶酶體膜的合成，同時線粒體也參與其中。
據以上的研究可知線粒體是自噬誘導信號ROS的主要來源之一，同時可能還提供部分自噬溶酶體膜合成的原料。線粒體來源的ROS轉運到胞漿產生一個氧化梯度，同時氧化其底物分子如Atg4及一些未知的分子，氧化的Atg4失去活性不能切割自噬溶酶體膜結合的Atg8，從而誘導自噬的激活。因為ROS是一類短壽命的物質，氧化過程只能在線粒體周邊，而在遠離線粒體的Atg4具有活性并可以分離位于自噬體上的底物Atg8使其參與循環利用。然而，目前還沒有儀器能夠檢測氧化梯度的變化從而證實這種推測。
5 ROS介導的自噬與疾病
ROS介導的自噬不僅與正常的老化相關，而且可以直接導致或加劇一些疾病的發生發展。一些與氧化有關的疾病中溶酶體系統功能受損起重要作用，如動脈粥樣硬化、AD和PD。雖然這些疾病在后期階段有著共同類似的改變即未消化物質在溶酶體內蓄積，但起初的氧化蛋白進入溶酶體的途徑各不相同。
5．1 ROS介導的自噬與動脈粥樣硬化
動脈粥樣硬化斑塊源自血管系統內溶酶體應對氧化損傷的反應。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)轉運膽固醇聚集到動脈壁內，隨后巨噬細胞遷移到膽固醇積聚的位置通過溶酶體來包裹清除氧化的蛋白。至后巨噬細胞內溶酶體堿性化導致溶酶體內未降解物質的積聚，巨噬細胞充滿了超載的溶酶體，成為吞噬活性有限的“泡沫細胞”。研究表明氧化的膽固醇及ROS在動脈粥樣硬化的進展中發揮重要作用，氧化的膽固醇通過損傷溶酶體從而影響自噬對于泡沫細胞的清除，而ROS隨著損傷細胞及胞外碎片的積聚而增加，從而使病變一直存在，我們的課題組通過培養人臍靜脈內皮細胞證實大自噬確實參與對ox-LDL的降解，在動脈粥樣硬化的形成中起著重要的作用。
5．2 ROS介導自噬和阿爾茨海默病
AD是老年人常見的神經退行性疾病，它的病理學特征為胞內具有毒性的肽片段Aβ-42的聚集。研究表明在Aβ-42聚集的早期就發現有大自噬的激活，并作為一種保護性機制阻止細胞進一步損害。隨著疾病的進展一方面自噬的活性下降且自噬溶酶體的融合障礙；另一方面Aβ-42抑制溶酶體的降解功能使聚集很快達到毒性水平，導致溶酶體內產生ROS。而過多的ROS可以抑制自噬體對其內物質的降解從而加劇內容物的積聚，使溶酶體膜內外的質子梯度改變并引起細胞死亡。盡管ROS參與了自噬介導的細胞死亡，但其在AD發病中的具體機制仍有待于進一步闡明。
5．3 ROS介導的自噬與PD
PD是以黑質致密部和紋狀體多巴胺能神經元內出現主要含有聚集α-synuclein的包涵體-Lewy小體為病理標志的神經變性疾病。多巴胺非常容易被氧化，胞內和胞外實驗證實DA的氧化與α-synuclein的積聚相關。大量研究表明，自噬參與了α-synuclein的降解過程：野生型α-synuclein蛋白通過CMA途徑降解，當α-synuclein過表達時，大自噬通常被誘導來彌補CMA缺陷。我們課題組通過構建表達突變型α-synuclein的PC12細胞系(A53T和A30P)，分別給于自噬誘導劑——雷帕霉素和抑制劑——渥曼青霉素，證實了在PD細胞模型中自噬水平的增高，促進自噬有助于細胞的存活。予以MPP+處理野生型、A30P和A53TPC12細胞，結果顯示野生型的α-synuclein可以抑制MPP+誘導的ROS的產生，而在A30P和A53T突變的PD模型細胞中，MPP+可以明顯增加ROS的產生，這表明ROS在α-synuclein的產生和清除中發揮著重要作用。
6結語
自噬是廣泛存在于真核細胞中的生命現象，這種現象的出現可能是在分化過程中促使細胞進行重新組織的需要而產生的，所以自噬與細胞的生長發育過程和多種疾病的發生、發展均密切相關。目前的研究表明ROS可以作為一些疾病治療的新靶點，具有潛在的治療價值。對于因自噬體的數量及活力下降引起的與蛋白降解障礙相關的老年性疾病，如PD、AD、糖尿病和動脈粥樣硬化等，可以通過上調ROS水平從而激活自噬來降解這些蛋白達到防治疾病的目的。同時ROS對于腫瘤的研究和治療也有很大的價值，已有研究證實一些藥物可以通過引起ROS增多而上調自噬以殺傷腫瘤細胞。盡管ROS，特別是線粒體來源的，是調節自噬過程的一種信號分子，但其誘導自噬的具體機制和通路還不是很清楚，ROS誘導的自噬性細胞存活和死亡之間的關系仍待于進一步研究。