陶丁瞿寧厚王純
《現代預防醫學》2009年21期
【作者單位】：四川省人民醫院皮膚外科；成都體育學院運動醫學系；
【摘要】：
[目的]
探討大鼠骨骼肌缺血再灌注后不同時相肌細胞Bax基因蛋白表達的變化。
[方法]
用免疫組織化學方法檢測并觀察大鼠右后肢止血帶缺血再灌注后4h、24h、48hBax基因蛋白在肌細胞中的表達情況；均以同組大鼠左后肢腓腸肌作自身對照。
[結果]
缺血再灌注后4h肌細胞內出現Bax蛋白表達，其陽性表達率為(5.97±1.44)%；
缺血再灌注后24h，肌細胞Bax蛋白表達的陽性率為(18.45±1.81)%；
缺血再灌注后48的肌細胞則未見Bax蛋白的表達；
所有各組左后肢肌細胞內亦無Bax蛋白的表達。
統計分析表明，缺血再灌注后24h組較之4h組、48h組以及實驗自身對照組差異有統計學意義(P﹤0.01)。
[結論]
本實驗研究表明，缺血再灌注損傷的肌細胞中有促進細胞凋亡基因Bax蛋白的陽性表達，其陽性表達率與缺血再灌注不同時相密切相關，以24h組更為顯著，此時病理損害亦更為顯著，提示Bax基因促發的細胞凋亡可能是骨骼肌缺血再灌注損傷病理機制中的一個組成部分。
肢體缺血是臨床常見的情況，恢復其血液循環是挽救缺血肢體的必須前提，而且血液循恢復得越早越好，這即所謂的再灌注。但是再灌注有時不但不能使缺血肢體恢復正常，反而會加重局部的代謝紊亂、功能障礙、甚至結構損傷，這即是缺血再灌注的局部損傷。再灌注損傷是Jennigs(1960)率先提出的。以后的工作證實，再灌注損傷作為一種普遍的病理生理過程存在于多種組織器官。肢體缺血時間的長短，不僅決定再灌注局部損傷的嚴重程度和是否能引起全身炎癥反應綜合征，甚至遠隔的多臟器功能障礙，其中肺是易受損的首位靶器官，表現為急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，肢體缺血時間的長短還可決定其是否存活。
肢體缺血的再灌注損傷主要是指骨骼肌的再灌注損傷，見于擠壓綜合征、骨筋膜室綜合征、止血帶和石膏、小夾板固定的錯誤使用、斷肢再植等。目前更關注對其所致急性肺損傷的作用和機制的探討，而對再灌注損傷肢體的研究不多。近年發現，細胞凋亡參與了再灌注損傷的病理過程并扮演重要角色。那么在肢體缺血再灌注損傷中，骨骼肌細胞凋亡是否也參與其中?這方面報告很少，而且結論迥異。究竟如何，值得我們進一步研究。
1材料和方法
1．1動物、材料和缺血再灌注損傷模型建立及大鼠分組
1．1．1試驗成年大鼠18只(由成都中醫藥大學動物實驗中心提供)，雌雄不限，體重300～350g，常規喂養，活動正常，質量合格。
1．1．2檢測所用Bax蛋白即用型試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑均購自美國Santacruz公司，其他試劑均系四川省人民醫院病理科提供。
1．1．3缺血再灌注損傷動物模型的建立是按臨床骨科膝關節手術時，先行驅血和在大腿上止血帶的方法模擬而成。具體方法是用3％戊巴比妥鈉對試驗鼠進行腹腔麻醉后，將其右后肢先用橡皮帶驅血，再用止血帶環扎于膝關節以上盡可能高的部位，其張力以恰好阻斷血供為度(該肢體蒼白，針刺無出血)，應用時間為1．5h。
1．1．4試驗大鼠隨機分為3組(n=6)，即缺血再灌注后4h組、缺血再灌注后24h組和缺血再灌注后48 h組，以同組大鼠左后肢腓腸肌作自身對照(試驗對照組)。
1．2方法
1．2．1病理學檢查
將實驗大鼠頸部脫臼處死，取腓腸肌常規固定，制片，片厚5μm。切片HE染色，分別觀察切片的組織學、病理學表現。
1．2．2免疫組化檢測
試驗方法和步驟按Bax蛋白即用型試劑盒的說明書進行。
1．2．3凋亡
肌細胞的判定標準上述免疫組化處理之切片，光鏡下凡肌細胞漿內有棕黃色著染者為Bax蛋白表達陽性，是為凋亡細胞。每張切片在400倍光學鏡下計數500個肌細胞中的陽性細胞，計算其百分率。
1．2．4陽性對照
取對Bax蛋白表達強陽性的大鼠正常結腸組織作上述免疫組化染色，以切片內對Bax蛋白表達陽性的血管內皮細胞為凋亡細胞陽性對照。
1．2．5陰性對照
撤除Bax蛋白單抗，其他同1．2．3。
1．3統計學處理
所得數據以x±s表示，組間比較用t檢驗，采用SPSS10．0統計軟件，P＜0．05為差異有統計學意義。
2結果
2．1病理學及免疫組化觀察檢測結果
2．1．1所有實驗大鼠自身對照側的腓腸肌均顯示正常肌組織，肌細胞形態正常，胞漿內橫紋清楚，細胞間結合緊密。免疫組化檢測未見可判斷為Bax蛋白陽性表達的肌細胞。
2．1．2缺血再灌注后4h組腓腸肌有不同程度的充血水腫，切面有血性液體溢出。鏡下見肌纖維有程度不一的水腫，局限性肌纖維紊亂，甚至消失，肌間質充血、滲液，小動靜脈充盈，可見中性粒細胞貼壁并浸潤至肌間隙，偶見壞死崩解的肌細胞液片狀外漏。免疫組化檢測可發現散在肌細胞漿內有Bax蛋白表達，其陽性表達率為(5．97±1．44)％。
2．1．3缺血再灌注后24h組鏡下可見肌間出血，滲液明顯增多，大量中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，間質血管壁增厚，有血栓形成，肌束內見散在的肌細胞漿內橫紋消失，呈斑紋樣或空泡樣改變，核消失。免疫組化檢測，Bax蛋白陽性表達的肌細胞明顯增多，但其細胞形態完整核致密或核消失，胞漿內有斑紋樣或空泡樣改變。Bax蛋白陽性表達的肌細胞占計數肌細胞的(18．45±1．81)％。
2．1．4缺血再灌注后48 h組腓腸肌充血水腫程度有所減輕，切面血性滲出明顯減少。鏡下見肌間質出血、滲液、中性粒細胞和巨噬細胞浸潤及肌纖維水腫均有所減輕，肌細胞間結合較松散，肌細胞核增多。免疫組化檢測，未發現有意義的Bax蛋白陽性表達的肌細胞。
2．2數據處理結果
實驗對照組缺血再灌注后48h組的大鼠骨骼肌細胞均無有意義的Bax蛋白陽性表達，其陽性表達率視為0；缺血再灌注后4h組肌細胞Bax陽性表達率為(5．97±1．44)％：缺血
再灌注后24 h組肌細胞Bax蛋白陽性表達率為(18．45±1．81)％。后者較之實驗對照組、缺血后再灌注后4h和缺血再灌注后48h差異均有統計學意義(P＜0．01)。
3討論
本文所見的骨骼肌缺血再灌注損傷的光鏡下表現與文獻報告相符，應該指出，動物下肢以止血帶缺血在2～3 h之內，一般不會造成整個缺血肢體不可逆損害。
3．1缺血再灌注損傷發生的機制
如Pack等所強調的，即缺血再灌注損傷發生根本的機制是氧自由基的大量產生和細胞內鈣超載以及隨之而來的微血管功能障礙。再灌注時，Ca2+大量內流激活了磷脂酶，降解膜磷脂，導致膜損害、脂質過氧化以及破壞細胞骨架并引發中性粒細胞的激活和浸潤；通過呼吸暴發釋放了大量的氧自由基(這與黃嘌呤氧化酶在再灌注時的活性過度增加有關)，蛋白水解酶及炎癥介質引發或加重細胞損傷，氧自由基還有細胞毒作用。在這些因素綜合作用下，在微血管內中性粒細胞和內皮細胞相互黏附作用明顯增加，其結果是造成微血管功能障礙并滅活一氧化氮(NO)。晚近的研究發現核因子-κB(NF-κB)和活化蛋白-1(Ap-1)這兩個核轉錄因子及其下游的促炎癥細胞因子如TNF-α和IL-6等在心肌缺血再灌注損傷期間的顯著表達，提示它們在缺血再灌注損傷發生中的關鍵作用，這對骨骼肌缺血再灌注損傷的研究具有一定的意義。
3．2關于細胞凋亡
3．2．1細胞死亡形式不止一種，已知的有壞死、凋亡以及有絲分裂細胞死亡(mitoticcell death)，后者又稱“有絲分裂災難”(mitoticcatas-trophe)，是近年發現的，經過有絲分裂的死亡方式，它與細胞分裂過程受阻有關。Majno 1995提出脹亡(oncosis)的概念，現認為這是細胞壞死的早期表現，不是獨立的細胞死亡方式。對3種死亡形式的研究，以對細胞凋亡的研究更受重視，并取得令人滿意的進展，其研究成果已應用于臨床。
細胞凋亡是基因調控的，是為維護機體內穩態的自主性死亡；是為適應內外環境變化，維護正常生長發育、正常生理狀況和功能，消除無功能甚至是有害細胞所必須的，這在胚胎發育中尤為重要，因之具有重大的生物學意義。細胞凋亡過程是以胞核DNA片段化裂解為特征，是一耗能的主動過程，有賴于mRNA和蛋白質的新合成。
缺血再灌注損傷時，不足引發壞死但又不可能恢復的肌細胞選擇了凋亡。對其要一分為二，負面影響是減少肌組織的實質成分，但也看到其正面作用，即不會像細胞壞死那樣產生“次級損傷”，即不會引發周圍組織的炎癥和免疫反應，這是有利的。
3．2．2缺血再灌注損傷肌細胞凋亡的誘發機制
哺乳動物細胞凋亡途徑有二，即線粒體途徑(胞內途徑)與死亡受體途徑(胞外途徑)。其中天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶(半胱天冬酶，Caspases)家族在這兩條途徑中都起著非常主要的作用。缺血再灌注損傷引發的細胞凋亡，與氧自由基的大量產生、鈣超載、線粒體通透性轉換孔道(MPTP)開放，一氧化氮(NO)的減少和鉀通道阻滯有關，更與上面提到的半胱天冬酶的活化直接有關，也與某些細胞因子的產生有關。近期的工作表明，核因子NF-κB是一組調控凋亡的重要轉錄因子。可見，引發缺血再灌注損傷的機制可能即是導致此時細胞凋亡的機制。
3．2．3缺血再灌注時細胞凋亡的基因調控很復雜，本文僅就凋亡Bcl基因大家族的Bax及bcl-2進行討論。bcl-2屬抗凋亡亞族，這一亞族中還有很多其他成員。bcl-2等對維持線粒體結構和功能的完整性起重要作用，它可增加線粒體內質子的外排，調節線粒體通透性粒轉換孔道，阻止C-myc(一種原癌基因)介導的凋亡，抑制與還原型谷胱甘肽含量下降相關的凋亡。bcl-2蛋白分子C端的羧基具有疏水性，含有一個由19個氨基酸伸展形成的跨膜結構，常位于線粒體膜。這一特點與bcl-2調節細胞凋亡的方式和能力非常有關。Bax則屬促凋亡亞族(又稱原凋亡亞族)的代表，同樣這一亞族中還有許多其他成員。它可促使線粒體釋放細胞色素C，從而促進細胞凋亡。Bax與bcl-2既可構成異源二聚體，也可自身組成同源二聚體，這取決于bcl-2和Bax之間的比例。異源二聚體占優勢時，有利于細胞存活。Bax同源二聚體占優勢時，則趨于凋亡。無死亡信號時，促凋亡基因以無活性形式分布于胞液或細胞骨架，抗凋亡基因作為細胞內膜結構的一部分被隔離。此時，兩者均無行動，不起作用。在缺血再灌注損傷時，有死亡信號發生，兩者均開始行動，一旦Bax的表達占優勢即可組成Bax同源二聚體，抑制了bcl-2的抗凋亡作用促進了肌細胞凋亡的發生。本研究表明，缺血再灌注后24h組的肌細胞有顯著Bax蛋白高表達，與bcl-2比例發生改變，組成Bax同源二聚體，從而抑制了bcl-2的抗凋亡作用，清除了難以修復的肌細胞。金旭紅等認為，制動導致骨骼肌萎縮之所以有明顯的細胞發生凋亡，可能是由于廢用以及固定引起的相對缺血缺氧所致。這與缺血再灌注損傷所致的肌細胞凋亡有一定的相似之處，因為缺血缺氧可導致線粒體損傷，而線粒體在細胞凋亡調節道路中起著十分重要的作用，前已述及，茲不再贅。在上述可能的諸多因素作用下，復雜的信號轉導系統失調，繁雜的凋亡調控基因網絡系統失控，從而發生肌細胞凋亡。但是正如bcl-2與Bax之間的關系失衡進而決定細胞是死是活的機制十分復雜，有待深入的研究。
本研究顯示，缺血再灌注損傷所致的細胞凋亡同樣可以發生在骨骼肌組織，而且肌細胞凋亡的程度與缺血再灌注不同時相有關，以再灌注后24h更為明顯。如何來防治缺血再灌注損傷，已引起國內外的廣泛注意，特別應重視缺血預處理的臨床應用研究，以挽救更多的缺血肢體。
(致謝：四川省人民醫院病理科楊紅老師在免疫組化工作中給子大力協助，特此感謝。)
(收稿日期：2008-11-24)