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北京生物醫(yī)學(xué)工程2000年第2期第19卷論著
作者：施巖孫大公陳凱謝利德姚偉娟文宗曜
單位：施巖(承德醫(yī)學(xué)院數(shù)學(xué)教研室承德067000)；
孫大公陳凱謝利德姚偉娟文宗曜
(北京醫(yī)科大學(xué)血液流變學(xué)研究中心北京100083)
關(guān)鍵詞：戊二醛；膜蛋白；新激光衍射法；生物力學(xué)特性
摘要
本文通過不同濃度戊二醛作用于紅細(xì)胞膜。用新型激光衍射法測(cè)量了這些紅細(xì)胞樣品的彈性模量E和膜粘度μm。同時(shí)通過DPH標(biāo)記的螢光偏振法測(cè)定了這些紅細(xì)胞膜的流動(dòng)性，并采用MSL標(biāo)記的電子自旋共振波譜技術(shù)(ESR)測(cè)量了紅細(xì)胞膜蛋白運(yùn)動(dòng)性的變化，并取得了與新型激光衍射法一致的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)膜蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，膜脂流動(dòng)性下降，紅細(xì)胞膜剪切彈性模量(E)和表面粘度(μm)均呈上升趨勢(shì)，紅細(xì)胞變形能力下降。并對(duì)上述紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變所引起的微觀流變特性的變化進(jìn)行了初步探討。
0前言
紅細(xì)胞膜的力學(xué)性質(zhì)主要由膜骨架的結(jié)構(gòu)決定，如果構(gòu)成膜骨架的各種蛋白相互之間的作用異常或某種蛋白有缺陷均可引起紅細(xì)胞膜力學(xué)性質(zhì)的改變，從而引發(fā)多種疾病。如遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥(HS)、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)等都是由于膜蛋白的缺陷或異常引起的。日本學(xué)者M(jìn)anno等人研究了骨架蛋白磷酸化和完整細(xì)胞膜的功能之間的關(guān)系，他們認(rèn)為細(xì)胞膜力學(xué)穩(wěn)定性受膜酪蛋白激酶I對(duì)beta-spectrin的磷酸化調(diào)控，beta-spectrin的磷酸化降低增加了細(xì)胞膜的力學(xué)穩(wěn)定性；反之磷酸化程度的增加降低了細(xì)胞膜的力學(xué)穩(wěn)定性。An XL和Takakuwa等人研究了紅細(xì)胞膜蛋白4.1和帶3蛋白相互作用對(duì)膜力學(xué)性質(zhì)的影響，他們發(fā)現(xiàn)隨著蛋白4.1與帶3蛋白的分離，帶3蛋白與錨蛋白的相互作用增強(qiáng)，使細(xì)胞膜的變形性下降，機(jī)械穩(wěn)定性增加。Gwozdzinski等人利用電子共順磁共振技術(shù)研究了慢性腎衰竭病人的紅細(xì)胞膜性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)慢性腎衰竭病人的紅細(xì)胞的滲透脆性比正常人有顯著增加，而且膜蛋白的運(yùn)動(dòng)性下降。即便在正常生理過程中隨紅細(xì)胞的衰老，紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)也在不斷發(fā)生變化，導(dǎo)致紅細(xì)胞剛性增加，終會(huì)被從血液循環(huán)系統(tǒng)中清除掉。我們?cè)群笱芯苛巳辫F性貧血大分子吸附，白蛋白對(duì)紅細(xì)胞微觀流變特性的影響及胰蛋白酶對(duì)紅細(xì)胞膜的水解作用。本文通過戊二醛作用于紅細(xì)胞膜，通過DPH標(biāo)記的螢光偏振法測(cè)定了這些紅細(xì)胞膜的流動(dòng)性，采用MSL標(biāo)記的電子自旋共振波譜技術(shù)(ESR)測(cè)量了紅細(xì)胞膜蛋白的構(gòu)象的動(dòng)態(tài)變化，并用新型激光衍射法測(cè)量了這些紅細(xì)胞樣品的彈性模量E和膜粘度μm。獲得對(duì)紅細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)的定量描述。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器
北京大白兔，由北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部供給；戊二醛(Glutaraldehyde)；馬來酰亞胺(MSL，Sigma公司)；DPH(NULL，6-二苯基1，3，5-乙三烯，Sigma公司)；聚乙烯吡咯烷酮PVP(polyvinlpyrolidone，分子量為30kD)。
BrukerESP300型電子自旋共振波譜儀；日立(HITACHI)850型熒光分光光度計(jì)；GYJ-I型自動(dòng)激光衍射，北京醫(yī)科大學(xué)與北京地質(zhì)儀器廠聯(lián)合研制；低溫高速離心機(jī)LG10-3A北京醫(yī)用離心機(jī)廠
1.2方法與步驟
1.2.1紅細(xì)胞膜(resealed ghost)制備
大白兔頸動(dòng)脈插管取血，肝素抗凝，離心去血漿及白細(xì)胞，加入等滲PBS離心，去上清，重復(fù)2次，得紅細(xì)胞。將pH7.9的低滲緩沖液在4℃左右按40∶1的體積加入紅細(xì)胞中，使之溶血，用高速冷凍離心機(jī)在12000rpm下離心，棄上清，如此重復(fù)4次，得白色細(xì)胞膜放入pH7.4的等滲PBS中使之封閉。
1.2.2用電子自旋共振波譜技術(shù)(ESR)測(cè)量經(jīng)戊二醛處理、馬來酰亞胺(MSL)標(biāo)記的紅細(xì)胞膜蛋白構(gòu)象及運(yùn)動(dòng)性的變化。
取細(xì)胞膜5份，每份200μl，分別用濃度為0、1/4000、1/3000、1/2000、1/1000(V/V)的戊二醛PBS緩沖液懸浮5min，然后立刻離心去上清，再用等滲PBS離心洗滌三次，以終止反應(yīng)。
將15μl的馬來酰亞胺(MSL)溶于800μl的PBS后加入各份樣品中進(jìn)行標(biāo)記，在冰水中攪拌4min，置于4℃冰箱過夜。上機(jī)測(cè)試前用PBS洗滌膜3～4次(10000rpm，10min)。
1.2.3用熒光偏振法測(cè)定經(jīng)戊二醛處理的紅細(xì)胞膜脂流動(dòng)性
用濃度為0、1/4000、1/3000、1/2000、1/1000和1/500的戊二醛處理細(xì)胞膜5min，然后迅速離心清洗終止反應(yīng)。每份樣品含400μg蛋白。
用熒光探劑DPH標(biāo)記紅細(xì)胞膜及上機(jī)測(cè)量熒光偏振度(P)。
1.2.4用新型激光衍射法測(cè)定經(jīng)戊二醛處理的紅細(xì)胞在C=0軌道上的小變形(DId)
兔耳緣取血，離心后去血漿及白細(xì)胞等，然后用等滲PBS離心清洗得純凈的紅細(xì)胞。
用戊二醛濃度分別為0、1/4000、1/3000、1/2000、1/1000的PBS緩沖液懸浮紅細(xì)胞，細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml，處理5min后迅速離心終止反應(yīng)。
測(cè)量紅細(xì)胞平均直徑。
將處理過的紅細(xì)胞分別用百分之3的PVP溶液(分子量30kD，其中含百分之0.04的牛血清白蛋白)懸浮，用新型激光衍射法測(cè)量紅細(xì)胞在C=0軌道上的小變形(DId)，測(cè)試條件為：剪切率=200s-1。
1.2.5用傳統(tǒng)激光衍射法測(cè)定經(jīng)戊二醛處理的紅細(xì)胞在高粘流場(chǎng)中大的變形指數(shù)(DImax)及變形恢復(fù)半衰減時(shí)間(t0.5)。
紅細(xì)胞準(zhǔn)備同(1.2.4)。
用戊二醛處理紅細(xì)胞同(1.2.4)。
經(jīng)戊二醛處理后的紅細(xì)胞用百分之15PVP懸浮，紅細(xì)胞濃度仍為2×107個(gè)/ml，用激光衍射法測(cè)量(i)紅細(xì)胞較大變形指數(shù)(DImax)；(ii)紅細(xì)胞變形恢復(fù)半衰減時(shí)間(t0.5)，測(cè)量條件為：較大切變率為1000s-1。
2結(jié)果與討論
經(jīng)戊二醛處理后，紅細(xì)胞膜的電子自旋共振譜的蛋白強(qiáng)弱固定比(S/W)結(jié)果如圖1所示。由圖可以看出，S/W值隨戊二醛濃度的增加而顯著增大，表明經(jīng)戊二醛作用后，紅細(xì)胞膜蛋白運(yùn)動(dòng)性下降。戊二醛是一種常用的同型雙功能交聯(lián)劑，它的兩個(gè)醛基可以與兩個(gè)相同或不同分子上的伯氨基形成Schiff氏堿，將兩分子以五碳鏈的橋聯(lián)接起來。經(jīng)戊二醛處理后，紅細(xì)胞膜蛋白產(chǎn)生不同程度的交聯(lián)，這種交聯(lián)作用對(duì)紅細(xì)胞膜上的蛋白空間取向、彼此間的相互作用勢(shì)必產(chǎn)生影響。由于橋聯(lián)的作用膜蛋白彼此間的約束加強(qiáng)，膜蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)趨于收縮。
采用熒光偏振技術(shù)測(cè)量的經(jīng)戊二醛處理后的紅細(xì)胞膜的熒光偏振度(P)，隨戊二醛的劑量增加而上升，結(jié)果如圖2，說明脂流動(dòng)性下降。由于膜蛋白與膜脂的相互作用，膜蛋白產(chǎn)生不同程度的交聯(lián)后進(jìn)而影響了膜脂的流動(dòng)性。隨交聯(lián)程度的增加對(duì)膜脂的流動(dòng)性影響越大，然而比較圖1和圖2，可以看到，S/W值的變化趨勢(shì)與P值的變化趨勢(shì)是不同的，說明膜蛋白的變化對(duì)膜脂流動(dòng)性的影響是非線性的。
利用文宗曜等人提出的新型激光衍射法，我們測(cè)定了經(jīng)不同濃度戊二醛處理的紅細(xì)胞在低粘低切變(η=3cp，γ=200s-1)流場(chǎng)中C=0軌道上的小變形DId，結(jié)果見表1。同時(shí)測(cè)量了經(jīng)不同濃度戊二醛處理后的兔紅細(xì)胞直徑，平均值為6.5±0.5μm。
利用施巖等人提出的公式：
分別代入不同戊二醛濃度下的小變形值DId以及紅細(xì)胞平均半徑，計(jì)算出不同戊二醛濃度下紅細(xì)胞的剪切彈性模量(E)，結(jié)果如圖3。
利用傳統(tǒng)激光衍射法我們分別測(cè)得不同戊二醛濃度下的紅細(xì)胞變形恢復(fù)半衰減時(shí)間t0.5，及紅細(xì)胞大的變形指數(shù)DImax，結(jié)果見表1。
根據(jù)施巖等人提出的公式：
將已獲得的E和t0.5代入上式，即可求得不同濃度戊二醛作用下紅細(xì)胞膜粘度(μm)，結(jié)果見圖4。
由圖3、4的結(jié)果可知，隨著膜蛋白交聯(lián)程度的增加，導(dǎo)致膜剪切彈性模量(E)上升，即紅細(xì)胞膜剛性程度上升，紅細(xì)胞粘度(μm)也明顯上升。膜剪切彈性模量(E)和膜粘度(μm)主要由紅細(xì)胞膜蛋白的性質(zhì)決定，利用傳統(tǒng)激光衍射法只能獲得紅細(xì)胞變形性的相對(duì)量DImax，而用新型激光衍射法我們獲得了描述紅細(xì)胞微觀力學(xué)性質(zhì)的物理量，說明新型激光衍射法在研究紅細(xì)胞微觀力學(xué)性質(zhì)上比利用傳統(tǒng)激光衍射法更為優(yōu)越。E和μm的增加導(dǎo)致了紅細(xì)胞變形能力的下降。
綜上所述，戊二醛作用于紅細(xì)胞膜后造成膜蛋白交聯(lián)，蛋白間結(jié)合位點(diǎn)增多導(dǎo)致膜蛋白運(yùn)動(dòng)性下降，構(gòu)象發(fā)生改變，蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)趨于收縮；在膜蛋白交聯(lián)作用的影響下膜脂流動(dòng)性降低；紅細(xì)胞膜剪切彈性模量(E)和表面粘度(μm)均呈上升趨勢(shì)，紅細(xì)胞剛性增加，紅細(xì)胞變形能力下降。用新型激光衍射法測(cè)得的膜剪切彈性模量(E)和表面粘度(μm)，很好地證明了戊二醛作用于紅細(xì)胞膜蛋白使之交聯(lián)而產(chǎn)生的膜蛋白構(gòu)象的改變。
作者簡(jiǎn)介：孫大公(1966-)，男，北京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)物理教研室講師。