郭平凡熊圣仁張金池林春忠陳元美
《中華實驗外科雜志》2005年01期
【作者單位】：福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普外科
摘要：
目的：
探討白細胞介素-1(IL-1)介導大鼠骨骼肌缺血再灌注損傷的作用及其機制。
方法：
24只健康雄性SD鼠，隨機分為：
假手術組：僅行頸外靜脈插管術；
損傷組：缺血4 h，再灌注4h；
干預組：缺血4 h，再灌注即刻經靜脈導管給與白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra).采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法測定骨骼肌和肺組織白細胞介素-1β(IL-1β)mRNA表達；
酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)測定血漿IL-1β水平；
比色法檢測血漿乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)和組織過氧化物酶(MPO)含量及電鏡觀察組織超微結構的改變。
結果：
應用IL-1ra后，IL-1βmRNA水平明顯降低(骨骼肌：0.73±0.35較1.20±0.42，P＜0.01；肺：1.15±0.23較1.70±0.30，P＜0.01)；
血漿IL-1β水平顯著下降(P＜0.01)；
CK(76.77±18.28較127.07±28.34，P＜0.01)、LDH(16 540.85±1 020.63較23 370.61±2 160.54，P＜0.01)、MDA(7.22±1.65較9.73±1.91，P＜0.01)和MPO(骨骼肌：2.24±0.38較4.43±0.65，P＜0.01；肺：1.13±0.16較2.71±0.32，P＜0.01)含量均明顯降低，骨骼肌和肺組織超微結構損傷減輕。
結論：
骨骼肌缺血-再灌注激發(fā)IL-1的生成，在介導骨骼肌和肺的損傷中起著重要作用。
骨骼肌缺血再灌注損傷(SMIRI)常見于溶栓、Fogarty導管取栓、斷肢再植、四肢大血管損傷等疾病恢復血流后。它的發(fā)生與過度炎癥反應密切相關。IL-1作為一種重要的促炎細胞因子，在炎癥反應中起重要的作用。我們以大鼠后肢缺血再灌注為模型，旨在觀察IL-1在SMIRI中的作用。
材料與方法
1．動物模型及分組清潔級健康雄性SD大鼠24只(福建醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，體重250～300g，隨機分為3組，每組8只。參照Crinnion等法建立模型。實驗分組：
(1)A組為假手術組，頸外靜脈插管，左后肢無張力環(huán)繞止血帶。
(2)B組為損傷組，缺血4h，再灌注4h，松開止血帶時經靜脈導管注入0．5ml生理鹽水。
(3)C組為干預組，缺血4h，再灌注4h，松開止血帶時經靜脈導管注入IL-1ra(2mg/kg)。
2．主要試劑：
IL-1ra(北京寶賽生物技術有限公司)，IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒(深圳晶美公司)，TrizolRNA抽提試劑盒(Gibcol BRL公司)，逆轉錄-聚合酶鏈反應試劑盒(Takara公司)，丙二醛、肌酸激酶、乳酸脫氫酶、過氧化物酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)。PCR引物由上海博亞公司合成，大鼠IL-1β基因上游引物：5’-GCAGGCTTCGAGATGAACAAC-3’，下游引物：5’-GCCGTCTTTCATCACACAGGA-3’，擴增片段約208bp。大鼠GAPDH內參引物序列：上游引物：5’-CTAAGTGTAGCCCAGGATGC-3’，下游引物：5’-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3’，擴增片段約508bp。
3．骨骼肌和肺組織總RNA提取及IL-1βmRNA基因表達：
再灌注4h后取大鼠左后肢骨骼肌(腓腸肌)及肺組織50～100mg分別加入1ml Trizol用玻璃勻漿器充分勻漿，提取總RNA。骨骼肌擴增條件為：94℃變性30s，50℃30s，72℃30s，共30循環(huán)，72℃延伸7min。肺組織擴增條件為：94℃變性30s，53℃30s，72℃30s，共30循環(huán)，72℃延伸7min。經2％瓊脂糖凝膠電泳后用GeL-Proanalyzer凝膠成像儀分析處理。
4．血漿IL-113含量檢測：
再灌注0、60、120、240min經頸靜脈采血按ELISA方法檢測。
5．MDA、CK、LDH、MPO測定：
再灌注4h經頸動脈取血并取骨骼肌及肺組織按常規(guī)用比色法檢測。
6．電鏡檢查：
骨骼肌取材后依次經3％戊二醛-1．5多聚甲醛混合液固定，1％鋨酸固定，乙醇丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鈣雙重染色后，用HU-12A型電鏡觀察并攝像。
7．統(tǒng)計方法：
數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示。采用Levene法行方差齊性檢驗。方差齊，用單因素方差分析，組間及組內用LSD檢驗：方差不齊，用Games-Howell法進行分析。
結果
1．骨骼肌和肺IL-1β基因表達的變化：
損傷組IL-1β的表達明顯增高(P<0．01)，干預組表達降低(P<0．01，表1)。
2．血漿IL-1β的變化：
骨胳肌再灌注后血漿IL-1β水平60min后明顯升高，120min達到高峰，干預組IL-1β明顯降低(圖1)。
3．血漿及組織生化指標測定結果：
損傷組再灌注4h血漿中MDA、CK、LDH與骨骼肌、肺組織中MPO含量均增高，與假手術組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0．01)。應用IL-1ra可使這些指標顯著降低(P<0．01，表2，3)。
4．電鏡觀察結果：
缺血-再灌注后4h，電鏡下可見骨骼肌肌絲、肌節(jié)排列紊亂，肌原纖維間隙增寬，線粒體腫脹變性，肌絲灶性溶解。肺泡腔內見紅細胞、脫落上皮細胞或細胞碎片，局部基膜裸露。肺泡間隔內毛細血管擴張淤血。應用IL-1ra后，上述病理變化明顯減輕。
討論
IL-1β是一種強烈的促炎細胞因子，除調節(jié)T細胞和B細胞介導的免疫功能外，還作用于中性粒細胞、巨噬細胞及血管內皮細胞，在炎癥反應和炎癥損傷中起著重要作用。以往研究證實IL-1β在缺血再灌注組織中表達升高，本實驗結果也顯示了相似的結果。過去研究還發(fā)現(xiàn)，腸缺血再灌注可致肺組織IL-1βmRNA表達增加，本實驗也證明了這一結果。由此表明再灌注激發(fā)的炎癥反應或炎癥損傷可誘使組織自身合成IL-1β，通過自分泌或旁分泌的形式，使組織損傷加重，提示內源性細胞因子IL-1β作為致病遞質參與了再灌注后組織損害的發(fā)生發(fā)展。Ascer等觀察表明，骨骼肌缺血再灌注血漿中IL-1β含量顯著升高，與本實驗損傷組血漿IL-1β含量升高相似，表明IL-1β是缺血再灌注激發(fā)的一種早期應激因子，該因子的含量在一定程度反映了炎癥反應或炎癥損傷的程度。本實驗結果顯示，IL-1ra能顯著降低損傷組血漿中IL-1β含量及幅度，抑制IL-1β在骨骼肌和肺組織中的表達。可見，骨骼肌缺血再灌注早期應用IL-1ra治療有助減輕IL-1β的過量表達，產生及其介導的炎癥反應，從而可抑制SMIRI的發(fā)生、發(fā)展。
本研究結果顯示，損傷組血漿MDA和組織MPO顯著增加。MDA含量可反映脂質過氧化程度并間接反映自由基的多少。MPO是中性粒細胞標志酶，通過測定MPO能反應中性粒細胞的浸潤程度。同時，血漿中骨骼肌細胞胞漿酶LDH、CK升高，組織超微結構發(fā)生明顯病理損傷。本實驗結果顯示，應用IL-1ra能減輕脂質過氧化程度及中性粒細胞的聚集；降低血漿中LDH、CK的含量并減輕組織損傷，證實IL-1β在SMIRI的發(fā)病過程中起關鍵性作用，IL-1ra對SMIRI具有保護作用。