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作者：夏舒萌張德琛吳小晶于衛(wèi)江史辛波陳立芳鄭戈
作者單位：解放軍第四六六醫(yī)院麻醉科，北京市，100089
期刊：中國臨床康復(fù)2005，9(2)
摘要：
目的：
觀察骨骼肌缺血再灌注后呼吸鏈電子漏、呼吸控制率、丙二醛和髓過氧化物酶的變化，評(píng)價(jià)3-硝基-N-甲基水楊酰胺(3-nitro-N-methy solicylamide，NSMA)對(duì)肢體缺血再灌注損傷的影響。
方法：
實(shí)驗(yàn)于1998-10/2000-05在解放軍第三0四醫(yī)院創(chuàng)傷外科研究室完成，制備缺血再灌注模型.將35只健康Wistar大白鼠，飼養(yǎng)環(huán)境清潔，合格證號(hào)軍醫(yī)動(dòng)字第B98008號(hào).隨機(jī)分為7組(對(duì)照組、缺血2 h、缺血2 h再灌注1 h、缺血2 h用NSMA再灌注1 h、缺血6 h、缺血6 h灌注1 h、缺血6 h用NSMA再灌注1 h)，選取不同時(shí)點(diǎn)骨骼肌標(biāo)本，提取骨骼肌線粒體、測定線粒體呼吸控制率、抗氰呼吸、經(jīng)皮測量動(dòng)脈氧分壓及局部相對(duì)血流量、測定骨骼肌丙二醛含量和髓過氧化物酶活性、對(duì)骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行透射電鏡檢測。
結(jié)果：
缺血2 h(1.45±0.10)、缺血2 h再灌注1 h(1.49±0.13)、缺血6 h(0.79±0.08)、缺血6 h灌注1h(1.32±0.07)RCR比對(duì)照組(2.82±0.25)、缺血2 h用NSMA再灌注1h(2.93±0.47)、缺血6 h用NSMA再灌注1 h(2.19±0.38)顯著下降(P＜0.01)；
缺血2 h用NSMA再灌注1 h組線粒體氧化磷酸化偶聯(lián)程度與對(duì)照組相似，缺血6 h用NSMA再灌注1 h組與相應(yīng)的缺血2 h、缺血2 h再灌注1 h、缺血6 h、缺血6 h灌注1 h組明顯提高；
缺血2 h(3.02±0.24)、缺血2 h再灌注1 h(3.30±0.08)、缺血6 h(3.36±0.22)、缺血6 h灌注1h(3.74±0.21)組抗氰呼吸分別比缺血2 h用NSMA再灌注1 h(0.22±0.05)、缺血6 h用NSMA再灌注1 h(1.46±0.30)組增加(P＜0.01)；
隨缺血的時(shí)間的延長，丙二醛濃度顯著增加(P＜0.01)，髓過氧化物酶的活性顯著升高(P＜0.01)，再灌注后丙二醛仍繼續(xù)增加(P＜0.01)，髓過氧化物酶的活性持續(xù)升高(P＜0.01)，相應(yīng)肢體組織的PO2在阻斷期0～1 mm Hg，2 h后再灌注的起初2 min血流量先恢復(fù)隨即減慢，但在阻斷6 h再灌注時(shí)血流基本停止，此時(shí)被阻斷的肢體無痛覺反應(yīng)；
病理改變?cè)谌毖俟嘧⒑蟾鼮閲?yán)重，缺血后預(yù)先應(yīng)用NSMA再灌注骨骼肌大部分線粒體完整。
結(jié)論：
伴隨著電子漏增加、線粒體活性降低，丙二醛濃度增加和髓過氧化物酶的活性增高與組織的損傷程度呈正相關(guān)；
NSMA能影響呼吸鏈電子傳遞，使氧自由基減少，進(jìn)而維持線粒體結(jié)構(gòu)的完整性和線粒體的功能活性，使細(xì)胞進(jìn)行正常的氧化磷酸化，減輕骨骼肌缺血再灌注損傷。
0引言
既往研究表明，活性氧代謝物是導(dǎo)致組織缺血再灌注損傷的主要原因之一。目前認(rèn)為缺血再灌注損傷與線粒體功能改變有重要關(guān)系。研究其發(fā)生機(jī)制，有效改善再灌注損傷過程中線粒體功能，是防治缺血性組織損傷的重要環(huán)節(jié)。本研究探討3-硝基-N-甲基水楊酰胺(3-nitro-N-methylsalicylamide，NSMA)對(duì)缺血再灌注骨骼肌線粒體的影響。
1材料和方法
設(shè)計(jì)：以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為研究對(duì)象，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，對(duì)照實(shí)驗(yàn)研究。
單位：解放軍第四六六醫(yī)院麻醉科。
材料：實(shí)驗(yàn)于1998-10/2000-5在解放軍第三0四醫(yī)院創(chuàng)傷外科研究室(系全軍燒傷研究所基礎(chǔ)部創(chuàng)傷外科研究室)完成。健康Wistar大白鼠35只，由解放軍第三零四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，體質(zhì)量180～240g，雌雄不拘。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一等級(jí)，飼養(yǎng)環(huán)境清潔，合格證號(hào)軍醫(yī)動(dòng)字第B98008號(hào)。
隨機(jī)分為7組，每組5只。7組分別為對(duì)照組(按缺血模型制備步驟行手術(shù)操作，但不阻斷右髂總動(dòng)脈)；缺血2h；缺血2h后再灌注1h；缺血2h后給藥NSMA再灌注1 h；缺血6h；缺血6h后再灌注1h；缺血6h后給NSMA再灌注1h。
試劑：牛血清白蛋白(BSA，無脂肪酸，BM分裝)；D-甘露醇(日本分裝)；ADP(北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心提供)。琥珀酸鈉(北京求賢化工廠產(chǎn)品)。實(shí)驗(yàn)中所用其他試劑均為分析純。
儀器：72型光電分光光度計(jì)。TOM-1型經(jīng)皮氧監(jiān)護(hù)儀。
設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估者：由第一作者主持設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)過程，由本文全部作者按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行干預(yù)和評(píng)估，經(jīng)過培訓(xùn)。
方法：
缺血再灌注模型的制備：參考Yokota等的方法制成。以30g/L戊巴比妥鈉按25～30mg/kg行腹腔麻醉，1～2h追加1/3藥量維持麻醉。剃毛、消毒后沿腹白線開腹，在近髂總動(dòng)脈處，以無創(chuàng)傷動(dòng)脈夾夾閉右髂總動(dòng)脈，制成右后肢缺血模型，按缺血不同的時(shí)間取下血管夾開始再灌流1 h或經(jīng)右股靜脈注入NSMA 1～1．5 mg/kg后再松開動(dòng)脈夾灌流1 h。
骨骼肌線粒體的提取：分別于各組設(shè)定的條件下迅速取下右腓腸肌1g在水浴中剪碎。加分離介質(zhì)(mmol/L)(甘露醇42、蔗糖14，EDTA0．2，HEPES 1，5g/LBSA 1 g)研磨制成骨骼肌勻漿并于4℃下600 g和10000g兩次10min離心后，獲得棕色沉淀即為骨骼肌線粒體。將沉淀懸浮于0．5mL分離介質(zhì)中。蛋白含量用考馬斯亮蘭測定。線粒體呼吸控制率的測定：用極譜法測定以琥珀酸為呼吸底物的線粒體呼吸控制率(respiratory control ratio，RCR)。反應(yīng)槽中放入測定介質(zhì)，加0．5mol/L琥珀酸10μL出現(xiàn)態(tài)4呼吸，2min后加0．5mol/L ADP10μL出現(xiàn)態(tài)3呼吸。
骨骼肌線粒體抗氰呼吸的測定：反應(yīng)槽內(nèi)加入所需測定介質(zhì)(mmol/L)(甘露醇60，氯化鉀2，TrB-HCl 2，KH2PO4 0．001，EDTA0．04)。加入0．5mol/L琥珀酸10μL，出現(xiàn)態(tài)4呼吸，再加入0．5 mol/LADP10μL出現(xiàn)態(tài)3呼吸，待ADP完全消耗又恢復(fù)態(tài)4呼吸時(shí)立即加入3g/L氰化鉀3μL。
經(jīng)皮氧監(jiān)測：固定GJYH-90型經(jīng)皮氧分壓傳感器連續(xù)、無創(chuàng)地測定動(dòng)脈氧分壓及局部相對(duì)血流量。
生化指標(biāo)測定：分別收集上述各組大白鼠右下肢腿部肌肉制備組織勻漿采用硫代巴比妥顯色法測定MDA含量和測定髓過氧化物酶主要在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，作了適當(dāng)改良。
骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察：隨機(jī)抽取部分實(shí)驗(yàn)組骨骼肌，按透射電鏡制備超薄切片，電鏡下(50000，60000放大倍數(shù))觀察并對(duì)線粒體的骨骼肌攝片。
主要觀察指標(biāo)：骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)，不同條件下呼吸控制率、抗氰呼吸、丙二醛、髓過氧化物酶的變化。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所得數(shù)據(jù)以x±s表示，由第一作者用SPSS 8．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)t檢驗(yàn)比較各組間的差異，P<0．05為差異有顯著性意義。
2結(jié)果
2．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量分析
選取Wistar大白鼠35只，分7組，每組5只，進(jìn)入統(tǒng)計(jì)分析的大鼠保持為7組，各5只，無缺失值。
2．2不同條件下呼吸控制率、抗氰呼吸、丙二醛、髓過氧經(jīng)物酶的變化
見表1。
2．3經(jīng)皮氧分壓及相對(duì)血流量
阻斷前，氧分壓(PO2)穩(wěn)定在8．0～9．8kPa，加熱功率(W)在262～304mW；阻斷中分別為PO2：0～1mmHg，W：4．5～6．2mW；阻斷2h再灌注的起初2minPO2：35mmHg，W：349mW，隨后PO2：18～20mm Hg，W：76～99mW；阻斷6h再灌注的PO2：0mmHg，W：1．0mW，此時(shí)被阻斷的肢體無痛覺反應(yīng)。
2．4骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化
與對(duì)照組比較：缺血組隨著時(shí)間延長到6h，大部分肌纖維排列紊亂，見糖元顆粒減少，可見線粒體膜斷裂，嵴消失；再灌注組隨缺血時(shí)間延長，肌纖維排列紊亂嚴(yán)重，糖元顆粒減少，線粒體膜斷裂，并出現(xiàn)自溶的髓樣小體；經(jīng)NSMA治療后的肌纖維排列紊亂有明顯改善，正常清楚，大部分線粒體完整，可見中等量的糖元顆粒。
3討論
NSMA為專一抑制泛醌反應(yīng)的呼吸鏈抑制劑，它對(duì)呼吸鏈中催化泛醌反應(yīng)的琥珀酸-泛醌還原酶，泛醌-細(xì)胞色素C還原酶和NADH-泛醌還原酶均有抑制作用。徐建興發(fā)現(xiàn)NSMA對(duì)提取的呼吸鏈酶系有明顯的抑制作用，用人工電子受體2．6-二氯酚吲哚酚鈉、吩嗪鉀硫酸鹽的實(shí)驗(yàn)觀察，推論NSMA抑制位點(diǎn)在呼吸鏈中吩嗪鉀硫酸鹽和DCHP的電子給體之間，這恰恰是復(fù)合物Ⅱ和Ⅲ相交接的地方。
呼吸鏈的電子漏是生物體中氧自由基(O2-)的恒定的主要來源。由于缺血供氧不足，線粒體內(nèi)呼吸鏈的電子傳遞紊亂，使電子傳遞鏈酶氧化還原狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原狀態(tài)，并引起還原當(dāng)量積聚，當(dāng)氧氣再次進(jìn)入組織時(shí)(再灌注期間)，積聚的還原當(dāng)量釋放電子與O2結(jié)合生成O2-，O2-經(jīng)超氧化物歧化酶歧化生成H2O2。氧自由基又反過來引起生物膜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過氧化，損傷線粒體膜的通透性，引起電子傳遞鏈酶活性的進(jìn)一步下降，形成惡性循環(huán)，從而使氧自由基生成進(jìn)一步增加，終造成細(xì)胞的壞死或凋亡。線粒體的氧自由基代謝狀態(tài)與細(xì)胞凋亡之間存在因果關(guān)系。孫緒德等在有關(guān)缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基生成等因素有關(guān)；缺血再灌注后，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，自身抗氧化能力減弱。卓安山等在研究中觀察到缺血再灌注損傷后在一定時(shí)限內(nèi)組織細(xì)胞主要表現(xiàn)為凋亡，很少發(fā)生壞死。
RCR是反映線粒體結(jié)構(gòu)完整性及其氧化磷酸化偶聯(lián)程度的靈敏指標(biāo)，是指加入ADP刺激后的呼吸(態(tài)3呼吸)和ADP耗盡后的呼吸(態(tài)4呼吸)之比。線粒體中，呼吸鏈將電子傳遞給氧的途中，“漏出”部分電子，引起氧分子進(jìn)行單電子還原產(chǎn)生超氧陰離子自由基O2-和雙氧水H2O2，這一路徑的耗氧是對(duì)氰化物不敏感的。
白細(xì)胞在骨骼肌缺血再灌注損傷中起重要作用。髓過氧化物酶由活化的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，是中性粒細(xì)胞的標(biāo)志酶。以往的研究表明，炎性反應(yīng)對(duì)大量的中性粒細(xì)胞活化是誘發(fā)器官功能障礙的危險(xiǎn)因素之一。PMN含有NADPH氧化酶，可還原分子氧為超氧陰離子；激活的中性粒細(xì)胞分泌髓過氧化物酶，催化過氧化氫和氯離子形成次氯酸。次氯酸為強(qiáng)氧化劑和超氧陰離子可氧化巰基，使血紅蛋白和細(xì)胞色素失活，再使蛋白質(zhì)降解而造成組織細(xì)胞損傷。
本研究結(jié)果表明，隨著缺血時(shí)間的延長，RCR呈下降趨勢(shì)，反映了在缺血、缺血再灌注后的線粒體活性顯著降低，氧化磷酸化偶聯(lián)程度下降。這意味著用于供能的氧耗減少，導(dǎo)致線粒體氧利用率降低。缺血后電子漏增加，再灌注后電子漏有增加趨勢(shì)。電子漏的增加勢(shì)必要影響呼吸鏈正常電子傳遞，使ATP產(chǎn)生減少，能量不足，從而導(dǎo)致抗氧化保護(hù)機(jī)制對(duì)氧自由基的清除作用減弱。實(shí)驗(yàn)說明缺血缺氧時(shí)組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加，MPO的活性增加，反應(yīng)了組織的損傷；再灌注后發(fā)生血流減慢直至停止，此時(shí)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物進(jìn)一步增加和MPO的活性持續(xù)增加，則反應(yīng)了缺血區(qū)域組織、除強(qiáng)氧化劑次氯酸和超氧陰離子造成組織細(xì)胞損傷外，尚有不可忽視的血管中有大量的白細(xì)胞積聚以至血管腔狹窄，并可引起繼發(fā)性血栓形成，從而使血管阻塞，缺血缺氧進(jìn)一步加重，這樣周而復(fù)始的惡性循環(huán)導(dǎo)致組織細(xì)胞的壞死或凋亡。伴隨著電子漏增加、丙二醛濃度增加、髓過氧經(jīng)物酶的活性增高，與組織的損傷程度呈正相關(guān)。NSMA能影響呼吸鏈電子傳遞，使氧自由基減少，進(jìn)而維持線粒體結(jié)構(gòu)的完整性和線粒體的功能活性，使細(xì)胞進(jìn)行正常的氧化磷酸化，從而減輕骨骼肌缺血再灌注損傷。沈明等在腦缺血再灌注損傷的研究中也觀察到NSMA對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
研究中還有一值得注意的問題，缺血再灌注時(shí)電子漏比正常對(duì)照組明顯增加，若這部分漏出電子均用于產(chǎn)生氧自由基，骨骼肌線粒體內(nèi)氧自由基水平應(yīng)顯著增高，可能損傷線粒體功能。但測得反映線粒體功能的RCR再灌注組均高于缺血組。依據(jù)徐健興提出的線粒體參與氧自由基代謝的功能，作者分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不相符有可能是再灌注期間氧氣進(jìn)入組織，由缺氧積聚的電子傳遞鏈酶還原當(dāng)量釋放電子，未全部用于產(chǎn)生氧自由基，部分尚未完全受損的線粒體抗氧化保護(hù)系統(tǒng)被激活。
結(jié)論：
缺血、缺血再灌注骨骼肌中線粒體RCR下降、電子漏增加，證實(shí)線粒體活性降低及其抗氧化保護(hù)作用減弱是發(fā)生缺血再灌注損傷的主要原因。NSMA為專一抑制泛醌反應(yīng)的呼吸鏈抑制劑，對(duì)缺血、缺血再灌注損傷有預(yù)防和治療作用。