何云凌吳麗穎朱玲玲范明
《生物化學與生物物理進展》2012年03期
【作者單位】：軍事醫學科學院基礎醫學研究所認知科學研究室
收稿日期：2011-05-06，接受日期：2011-11-04
【摘要】：
低氧是一種典型的應激環境，細胞在低氧條件下能量和氧化代謝發生改變，其中線粒體產生的大量活性氧嚴重威脅細胞的存活。線粒體自噬是近年來被發現的細胞適應低氧的一種適應性代謝反應。細胞在低氧條件下能通過上調低氧誘導因子1(HIF-1)，激活BNIP3/BNIP3L及Beclin-1介導的通路誘導線粒體自噬，終減少ROS的產生，促進細胞的存活，使機體產生低氧適應。綜述了線粒體自噬在低氧適應中的作用及其機制。
氧在生命體能量代謝和穩態平衡中具有至關重要的作用，它是維持機體正常發育和生長重要的生命要素。機體多種器官或組織處于生理性低氧狀態中，并且這種低氧環境影響著機體的生理機能。然而，人們更關注的是病理狀態下的低氧對人類健康的威脅，如心、腦缺血/缺氧及高原等特殊低氧環境對機體造成的損傷。因此，研究低氧對機體功能的調節具有重要意義。
線粒體是對低氧反應尤為敏感的細胞器，在低氧下線粒體功能將發生重大調整以適應低氧環境。細胞在低氧應激時受到的至大威脅并不是由于線粒體氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)受抑制而導致的ATP生成的減少，而是電子傳遞鏈至后的電子受體氧分子供應不足導致活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量產生。ROS恣意攻擊細胞內的脂類、蛋白質、DNA等大分子物質，甚至是細胞器，使它們發生氧化損傷，終威脅細胞的生存。所幸，細胞中存在著一系列調控氧化還原穩態的機制，線粒體自噬便是新近被發現尤為重要的調控途徑之一，細胞通過降解受損或老化的線粒體保障細胞內氧化還原的穩態。目前這種適應性代謝機制在低氧應激等領域正受到密切的關注。
1低氧
在正常的生理狀態下，機體的器官或組織并非處于20％的氧環境中，而是處于一種相對低氧的環境，這就是生理性低氧。例如，在胚胎發育過程以及成體腦組織中氧均處于較低的濃度，并且這種低氧環境對于胚胎發育和成體腦組織行使正常生理功能是重要的。而另一方面，機體正常的氧供給如果得不到保障會造成一系列的病變，例如高原低氧引起的高原病、心肌缺血造成的心肌損傷、腦中風或腦缺血引起的神經退行性疾病、新生兒圍產期缺氧導致的腦癱等。此外，惡性腫瘤生長過程中，因增殖過快造成局部組織嚴重缺氧，這也正是腫瘤的重要特征之一。因此，研究低氧導致的機體代謝功能的變化及其發生改變的機制，不僅有助于人們對胚胎發育、成體內神經系統活動等正常生理功能的了解，還有助于人們對缺血缺氧性疾病，以及癌癥等多種疾病發病機理的認識，促進對相關疾病的預防和治療。
2線粒體自噬
2．1細胞自噬與線粒體自噬
自噬(autophagy)是一種通過形成雙層膜的自噬體(autophagosome)包裹胞質、細胞器和蛋白質聚合物，并運送至溶酶體進行分解代謝的過程。過去，自噬一直被視為一種死亡程序誘導的細胞死亡。而近些年的研究發現，自噬是對低氧、營養匱乏、病原體感染等外源性刺激的重要適應性反應。它不僅能通過降解形成氨基酸、核苷酸等物質供能量循環，還能作為一種防御機制清除胞質內受損的細胞器和代謝產物，保護受損的細胞。通過藥物處理等抑制細胞自噬的發生，能促使細胞在外界條件刺激下發生凋亡，則反向證明了細胞自噬的保護性作用。根據降解靶物是否具有特異性，將自噬分為兩種類型：即營養匱乏能誘導細胞發生非選擇性的自噬，該類型的自噬目的是維持基本的物質能量代謝；另一種是在營養供應充足的條件下發生的靶物特異性的自噬，主要是清除受損的細胞器和代謝產物，防止其對細胞造成進一步的損傷。靶物特異性的自噬包括線粒體自噬(mitophagy)、過氧化物酶體自噬(pexophagy)、核糖體自噬(ribophagy)等，其中線粒體自噬作為細胞內自噬的一種形式，正因為其能在多種病理生理條件下發揮重要的促存活作用而受到人們的關注。
在早期肝細胞糖代謝功能的研究中，人們在電子顯微鏡下初次觀察到哺乳動物細胞中存在溶酶體包裹隔離線粒體的現象。Lemasters等在總結酵母研究中發現這種線粒體特異性的自噬現象，于2005年初次提出“線粒體自噬(mitophagy)”的概念，隨后，進一步的研究證實，線粒體損傷能誘導線粒體特異性自噬的發生。在酵母中的研究發現，與自噬相關的Atg32(autophagy related gene 32)基因以自噬受體的形式參與線粒體的自噬降解，但Atg32的表達并不影響其他途徑自噬的發生。而在哺乳動物中的研究發現，當線粒體受到損傷并導致膜電位(mitochondrial membrane potential，Δψm)降低時，能通過帕金森病相關蛋白PINK1和Parkin介導的通路誘導線粒體自噬的發生。PINK1是一種線粒體膜蛋白，在正常條件下以線粒體膜電位依賴性的方式被快速降解，線粒體膜電位的降低能穩定PINK1蛋白，使線粒體膜上的PINK1聚集，這樣PINK1就能招募具有E3泛素連接酶活性的Parkin從細胞質中轉位至功能紊亂的線粒體上，由PINK1招募的Parkin隨后將線粒體底物進行泛素化標記，并導致線粒體發生自噬性降解。此外，研究發現，Bcl-2家族中的NIX能通過誘導線粒體膜電位的降低使自噬體特異性地識別和降解線粒體，并且這種NIX依賴性的線粒體自噬對于紅細胞成熟過程中線粒體的清除是重要的。上述的研究結果證實，線粒體自噬不僅是一種具有選擇性的自噬過程，它還在疾病防御和機體發育中發揮著重要的作用。
2．2凋亡與線粒體自噬
自噬與細胞死亡存在密切的聯系。一方面，在應對低氧等多種應激環境時，自噬能通過降解錯誤折疊的蛋白質和損傷的細胞器防止細胞觸發凋亡途徑，發揮重要的細胞保護作用。另一方面，在長期或劇烈的外界環境刺激下，持久的自噬則會直接導致細胞的死亡。
線粒體是細胞中氧化還原平衡以及能量代謝的重要場所，也是細胞凋亡的主要調節部位，因此在細胞生存和死亡中扮演著重要角色。通過氧化磷酸化產生ATP是線粒體尤為重要的功能之一，線粒體通過氧化磷酸化產生ATP的同時，還伴隨產生O2、H2O2等多種ROS。應激條件下，線粒體外膜如果因受ROS攻擊而破裂會使線粒體向胞質內釋放細胞色素c、凋亡誘導因子(apoptosis-inducingfactor，AIF)等凋亡相關蛋白，從而誘導細胞進入凋亡途徑．但是，線粒體自噬可以作為一種防御機制能清除損傷的線粒體和過量產生的ROS，確保細胞內線粒體功能穩定，促進應激環境中細胞的存活。反之，如果線粒體自噬的防御功能得不到充分發揮，過量產生的ROS將誘導細胞進入凋亡等途徑，導致細胞死亡。
3低氧通過HIF-1、ROS調控線粒體自噬
低氧廣泛存在于多種病理生理環境中，對細胞中線粒體的功能影響尤其大。氧濃度的降低會抑制線粒體的氧化磷酸化功能，導致線粒體產生更多的ROS，致使氧化還原代謝紊亂。線粒體自噬能通過減少ROS的產生平衡這一代謝紊亂。那么，在低氧條件下線粒體自噬如何被激活?其調控途徑有哪些?闡明這些問題將有助于人們對機體自我調節的低氧適應有更深入的理解。
3．1 HIF-1
低氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)是機體維持氧穩態信號系統中關鍵的異二聚體轉錄因子，由一個受氧調節的。亞基和一個組成型表達的β亞基組成。常氧條件下，脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylases，PHDs)會將HIF-1α402和564位點上的脯氨酸殘基羥基化，從而使HIF-1α被腫瘤抑制蛋白VHL(vonHippel-Lindau)識別進入泛素化-蛋白酶體途徑降解。另一方面，HIF-1抑制因子(factor inhibiting HIF-1，FIH-1)能將HIF-1α803位點上的天冬酰胺殘基羥基化，阻止HIF-1α與轉錄共激活因子CBP/p300的結合，從而抑制HIF-1的轉錄活性。低氧條件下，PHDs由于缺乏底物O2使羥基化受阻，HIF-1α得以穩定表達。此外，當FIH-1活性受到低氧抑制時，可以解除對HIF-1轉錄活性的影響。HIF-1α入核后與β亞基形成HIF-1異二聚體，HIF-1靶向性地與低氧反應元件(hypoxia responsiveelement，HRE)結合，并調控下游基因的表達。受到HIF-1調控的下游基因多達數百種，它們參與調節線粒體及糖代謝、血管及紅細胞生成、胚胎發育、細胞死亡及增殖分化、炎癥和腫瘤生長等多種病理生理過程。
3．2 ROS與HIF-1
線粒體是氧化磷酸化的場所，是細胞的主要供能單位，同時也是細胞消耗氧的主要細胞器。線粒體功能的正常行使依賴于氧的正常供應。在低氧條件下，線粒體電子傳遞鏈因為沒有充足的氧分子充當電子的受體而發生紊亂，電子傳遞鏈通過復合體Ⅰ(NAOH脫氫酶)，復合體Ⅱ(琥珀酸脫氫酶)和復合體Ⅲ(細胞色素c還原酶)產生大量的ROS。ROS中H2O2的增多能通過激活Rac或Rho等小GTP酶(smallGTPases)介導的信號通路抑制PHDs的催化活性，從而穩定HIF-1α。穩定表達的HIF-1先能激活丙酮酸脫氫酶(PDH)激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase 1，Pdk1)基因的表達，PDK1通過磷酸化作用使PDH的催化亞基失活，從而阻礙丙酮酸轉化為乙酰輔酶A進入線粒體的三羧酸循環，這樣就減少了由電子傳遞鏈產生的ROS。另一方面，HIF-1能通過激活下游基因的表達改變電子傳遞鏈復合體的結構，進而抑制ROS的產生(圖1)。研究證明，低氧條件下，HIF-1通過激活細胞色素c氧化酶由COX4-1向COX4-2轉變，這種轉變抑制了電子傳遞鏈中ROS的產生。此外，近期的研究還顯示，HIF-1能夠調節低氧條件下細胞miRNA-210的表達，而miRNA-210能抑制電子傳遞鏈復合體Ⅰ中必需組分鐵硫簇組裝蛋白ISCU1/2的表達，因此通過影響復合體Ⅰ的正常表達，從而調節ROS的產生。
當細胞遭受劇烈或長期的低氧刺激時，會產生大量的ROS打破上述幾種維持氧化還原穩態的機制，從而對線粒體造成傷害。研究發現，在細胞中還存在著一種由HIF-1介導的線粒體自噬途徑，能夠通過改變代謝方式來適應這種低氧刺激，促進細胞存活。
3．3 HIF-1調控線粒體自噬的作用途徑
在HIF-1下游的諸多靶基因中，有一類能編碼調節細胞死亡的蛋白質．BNIP3(Bcl-2 and adenovirus E1B 19kDa-interacting protein 3)和BNIP3L(BNIP3-like)是兩種受HIF-1直接調控的細胞死亡相關蛋白，它們均為Bcl-2家族中只含BH3結構域(The Bcl-2 homology domain 3-Only，BH3-only)亞家族中的成員。BNIP3是BH3-only家族中的一員，也是一種HIF-1依賴性的基因，其啟動子中含有HRE，并且在適度低氧條件下能被誘導表達。BNIP3L也被稱為NIX，是一種BNIP3類似物，與BNIP3擁有56％的序列同源性，它同樣也是BH3-only家族中的一員并能被低氧誘導表達。過去，BNIP3和BNIP3L被普遍認為是促凋亡蛋白，在腫瘤細胞遭受低氧時被誘導表達并與細胞死亡密切相關。然而，近期的一些研究發現，BNIP3和BNIP3L在促進細胞存活的自噬過程中發揮著重要作用。2008年，Zhang等證明了低氧能通過BNIP3依賴的方式誘導線粒體自噬。另外，在大鼠心臟組織的研究也發現，HIF-1依賴性的BNIP3表達對于線粒體自噬是重要的。與BNIP3相似，Sandoval等在紅細胞的實驗中證明，BNIP3L能引發線粒體自噬并且在紅細胞分化過程中很重要。Bellot等在多種正常細胞和癌細胞中均證實，當細胞經受低氧(1％O2)或者嚴重缺氧(0．1％O2)處理時，能通過HIF-1介導的BNIP3和BNIP3L表達促使線粒體自噬的發生，從而防止細胞死亡，甚至在經過一周低氧處理后這種現象仍然能被觀察到。
BNIP3和BNIP3L是低氧誘導激活線粒體自噬發生中的重要信號分子，它們是通過怎樣的機制激活線粒體自噬呢?Beclin-1在BNIP3/BNIP3L介導的線粒體自噬通路中起重要作用(圖1)。Beclin-1是酵母中自噬相關基因Atg6在哺乳動物中的同源物，被認為在激活自噬前體結構中具有重要作用，調控自噬體的形成。Beclin-1也是一種只具有BH3結構域的蛋白質，因此Beclin-1能通過BH3結構域與Bcl-2或者Bcl-XL相結合，而BNIP3和BNIP3L也均是因為具有BH3結構域，方可與Beclin-1競爭性地和Bcl-2或者Bcl-XL結合。當BNIP3和BNIP3L表達升高時，Beclin-被從Bcl-2/Beclin-1或Bcl-XL/Beclin-1復合物中釋放出來，游離的Beclin-1能與多種蛋白質共同形成Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)復合體，該復合體能通過PI3K/Akt途徑調節下游多種自噬相關的Atg蛋白在自噬前體結構中的定位，從而激活線粒體自噬的發生。Zhang等在小鼠胚胎成纖維細胞(mouseembryonic fibroblast，MEFs)上利用短發夾結構RNA特異性地阻斷Beclin-1的表達，能抑制HIF-1依賴的BNIP3途徑介導的促細胞存活作用，而用siRNA靶向性抑制Atg5能產生與抑制Beclin-1表達相同的結果。Beclin-1是激活自噬的上游信號分子，而Atg5是線粒體自噬執行過程中的關鍵蛋白，因此Atg5在低氧條件下對于Beclin-1激活的自噬發生起重要介導作用。
研究證實，Beclin-1還參與缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，IR)引起的線粒體自噬的發生。IR中由于氧化應激的產生而對組織器官造成損傷。為了減少這種損傷，機體會通過激活自噬或者凋亡來維持內環境的氧化還原穩態。當IR對心肌細胞造成損傷后，心肌細胞中的自噬過程也受到相應的影響，通過過表達Beclin-1能增強自噬過程，對細胞產生保護效應。IR誘導并激活線粒體自噬的現象不僅在心肌細胞中被觀察到，而且在腎細胞和肝細胞中也觀察到同樣的現象。研究發現，IR能誘導腎臟中Beclin-1的表達，引起自噬的發生，而過表達Bcl-XL能降低這種誘導效應。在肝臟中通過誘導Beclin-1等自噬相關蛋白的表達能產生類似于IR的作用。上述的這些研究結果暗示了缺血/再灌注過程中，通過線粒體自噬清除受到ROS損傷的線粒體，這在細胞減緩低氧損傷和促進存活中起著重要的作用。
Beclin-1介導的自噬途徑在低氧誘導的線粒體自噬中起著關鍵的作用，但它并不是BNIP3和BNIP3L調節自噬的僅有通路。有一種理論認為，BNIP3和BNIP3L能直接引發線粒體膜的去極化，而線粒體的去極化足以導致線粒體發生自噬。另有研究報道，BNIP3L能與自噬發生所必需的Atg8家族中的成員相互作用，特別是γ-氨基丁酸受體相關蛋白(GABA-receptor-associatedprotein，GABARAP)和LC3(microtubule-associated protein1 light chain 3，MAP 1 LC3)。LC3是哺乳動物中存在的酵母自噬相關基因Atg8的同源物，也是一種泛素類蛋白，在線粒體自噬中起重要作用，同時也是一種自噬體標志物。BNIP3L與已經證實的Atg8相互作用因子p62相似，都含有LC3相互作用區并能與GABARAP和LC3相互作用。研究發現，表達并定位于線粒體外膜上的BNIP3L與自噬體標志物GABARAP和LC3的結合介導自噬體靶向性清除損傷的線粒體。
3．4 ROS調控線粒體自噬的作用途徑
線粒體中ROS的大量產生導致氧化失衡是誘導適應性線粒體自噬的主要原因。ROS造成的氧化應激不僅能通過HIF-1介導的信號途徑誘導線粒體自噬的發生，還能通過激活其他多種信號分子控制的途徑對細胞自噬進行調節(圖1)。
研究發現，外源H2O2處理能導致氧化應激和線粒體損傷的產生，并激活自噬。在氧化應激條件下，堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的轉錄因子NRF2(nuclear factor erythroid 2-related factor2)能誘導p62蛋白的表達，p62反過來又能激活NRF2，進行反饋調節。p62也被稱為SQSTM1(sequestosome 1)，它能將氧化損傷或者未折疊的蛋白質運送至自噬途徑降解。p62還能與LC3相互作用，在連接自噬體和損傷線粒體中起靶向調節作用。此外，ROS還能通過另一種低氧誘導因子HIF-2α(hypoxiainducible factor-2)調控自噬。在小鼠中的研究發現HIF-2α能調節超氧化物歧化酶2(superoxidedismutase 2，SOD2)的活性并減少ROS含量。研究還發現低氧誘導上調的HIF-2α能通過激活轉錄因子FOXO3(forkhead boxO3)調節BNIP3的表達。長期低氧時，轉錄因子PERK(PKR-like ERkinase)能被激活，并誘導其下游LC3和Atg5的轉錄，進而調控自噬。ROS還能通過多種其他途徑誘導細胞中非線粒體途徑的自噬，降解細胞中受損傷的大分子物質以及細胞器，達到促進細胞存活的作用。
4小結及展望
線粒體自噬作為一種選擇性的細胞自噬途徑，與細胞的其他自噬相似，在細胞生存中發揮重要作用。特別是當細胞受到以低氧應激為代表的外環境刺激時，線粒體自噬能通過特異性降解受損的線粒體來防止進一步的損傷，保護細胞存活。同樣在多種病理生理條件下，線粒體自噬能通過降解細胞內受到損傷的線粒體和清除過量產生的ROS來防止細胞進入死亡途徑。因此，細胞通過線粒體自噬這一主動調節過程能增強機體在低氧等環境下的適應能力，也有可能成為相關疾病的預防與治療的潛在靶點。