晉雯高美欽周琳瑛張文敏
《福建醫科大學學報》2006年03期
【作者單位】：福建醫科大學病理學系
摘要：
目的：
探討肌營養不良癥(DMD)受累肌肉中細胞凋亡的表達及其與病變程度的關系。
方法：
5例無皮膚肌肉病變的外科手術患者(對照組)和30例DMD患者(DMD組)，局部取骨骼肌標本行活組織檢查，應用TUNEL原位末端標記法及免疫組織化學法檢測細胞凋亡及Caspase3表達情況。
結果：
DMD組TUNEL及Caspase3陽性率分別為76.67%和86.67%，陽性細胞主要分布在壞死或萎縮肌纖維中，對照組呈陰性表達。陽性率與病程長短有關(r=0.437，P<0.05)，與年齡無關(r=-0.273，P>0.05)。凋亡指數與Caspase3表達呈正相關(r＝0.536，P<0.05)。
結論：
人類肌營養不良癥骨骼肌細胞凋亡與肌纖維萎縮、壞死有一定關系。
關鍵詞：肌營養不良；肌萎縮；凋亡；Caspase3
進行性肌營養不良癥(DMD)是一組骨骼肌呈進行性消耗和肌力減弱的遺傳性疾病，直接累及肌纖維，多數患者在20歲以內死亡，另一些患者雖然存活，但逐漸喪失生活能力。肌纖維退變、壞死和再生是DMD共同的病理特征，近年來細胞凋亡與骨骼肌發育及退變之間的關系日益引起重視。有研究顯示，在失神經支配及皮肌炎等疾病中，細胞凋亡在肌肉損傷過程中發揮作用，但與DMD的關系尚未闡明。半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶(Caspase)是一類位點特異性蛋白水解酶，在細胞凋亡的信號轉導中起著重要作用，處于信號轉導通路的中心位置。其中Caspase3是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路，是哺乳動物細胞凋亡中的關鍵蛋白酶，也是細胞凋亡的主要效應因子和重要的凋亡執行者，在凋亡的執行階段，負責全部或部分關鍵性蛋白酶切，使之激活或滅活，其水解底物多是細胞中的功能蛋白質，分別參與DNA修復、mRNA降解、固醇生物合成和細胞骨架重建等。筆者選取5例正常肌肉及30例DMD采用TUNEL方法及免疫組織化學法進行細胞凋亡的檢測及Caspase3表達情況的研究，以探討肌纖維萎縮、壞死與DMD的關系。
1材料與方法
1.1對象
1990～2003年福建醫科大學病理學系確診為DMD的存檔標本30例，男性25例，女性5例，年齡(18.22±13.79)歲(4～50歲)，病程(5.15±4.65)年(1～20年)，其中終末期3例。對照組系無皮膚肌肉病變的外科手術患者5例，男性3例，女性2例，年齡（35.2±19.13)歲(16～57歲），其中4例為骨折患者，1例為食道癌患者。
1.2主要試劑
原位細胞死亡檢測試劑盒(北京中山生物技術有限公司)，鼠抗人Caspase3(美國NeoMarkers公司)
1.3方法
所有蠟塊重新制成4μm厚切片，常規脫蠟脫水，進行TUNEL及Caspase3染色，陽性對照由試劑盒提供，陰性對照由PBS代替一抗，按說明書操作。
1.4結果判斷
1.4.1 TUNEL法檢測肌纖維凋亡
選每張陽性切片中凋亡小體數更多的高倍視野10個，計數細胞和凋亡小體數，取10個視野的平均值為凋亡指數(AI)。AI<5%為(-)，≥5%～10％為(+)，11%～15％為(++)，>15%為(+++)。
1.4.2免疫組織化學法檢測Caspase3
陽性細胞細胞質染成棕黃色，根據細胞著色深度、范圍進行半定量檢測，高倍鏡下選擇10個視野計數，Caspase3陽性細胞數占肌纖維細胞數<10%為(-)，10%～25%為(+)，26%～50%為(++)，>51%為(+++)。
1.5統計學處理
所有數據在SPSS 10.0軟件包中進行Fisher準確概率法及相關分析。
2結果
大多數DMD病例中肌纖維大小不一，各肌束均可見輕、中度圓形萎縮肌纖維及肥大纖維散在分布，可見灶性肌溶解壞死、吞噬反應及不透明纖維，間質纖維脂肪組織輕度增生。終末期病例的間質纖維結締組織、脂肪組織大量增生。對照組正常肌組織TUNEL呈陰性反應，DMD中TUNEL陽性率76.67％(23/30)，差別有統計學意義(P<0.05)。陽性細胞核著色為深棕色，細胞核大小異常，或大于正常2倍以上，或小于1/2，細胞核外形異常，常為扇貝狀、波浪狀，主要分布在壞死或萎縮肌纖維中(圖1)。DMD中7例(-)，其中3例為終末期患者；1例(+)，4例(++)，18例(+++)。Caspase3在正常肌組織中呈陰性表達，細胞質不著色；DMD陽性率86.67％(26/30)，陽性細胞著色為深棕色，主要分布在壞死或萎縮肌纖維中，陽性率與病程長短有關(r=0.437，P<0.05)，而與年齡無關(r=-0.273，P>0.05)。凋亡細胞及Caspase3在DMD中表達呈正相關(r=0.536，P<0.05)。
A：對照組肌組織未見陽性表達；B：DMD肌纖維可見凋亡小體(↑)
圖1正常肌組織和DMD肌組織肌纖維凋亡(TUNEL染色×400)
3討論
細胞凋亡是細胞在基因調控下的主動性死亡，具有獨特的形態結構和生物化學特征，與細胞壞死明顯不同，其對保證個體正常發育成熟，維持機體正常生理功能和自身穩定，參與腫瘤形成，對于許多疾病的發生有重要的生物學意義。秦瑞峰等在肌細胞的分化、發育過程中觀察到凋亡現象的存在，因此認為凋亡的研究對于認識肌肉系統疾病有重要的意義。
DMD是一組骨骼肌呈進行性消耗和肌力減弱的遺傳性疾病，直接累及肌纖維，多數患者在20歲以內死亡，另一些患者雖然存活，但逐漸喪失生活能力。目前確認肌纖維退變、壞死和再生是DMD共同的病理特征，但對壞死是如何啟動的知之甚少。近年來有研究發現，哺乳動物在胚胎骨骼肌生長的早期階段40％以上肌細胞通過凋亡方式清除，體外肌細胞培養證實分化成熟的肌細胞存在凋亡，在肌病發展過程中通過調節肌母細胞增殖和分化通道可導致凋亡的發生，表明細胞凋亡與肌病病變發展有一定關系。有研究發現，成年肌營養不良小鼠變化壞死的肌纖維因凋亡所致，推斷在人類肌營養不良癥肌纖維壞死中凋亡可能起一定作用。
筆者在顯微鏡下觀察到，DMD中受累肌纖維壞死后可見巨噬細胞浸潤及吞噬反應，罕見有其他炎癥細胞浸潤，這與凋亡發生后無炎癥反應的形態學改變一致。另外，實驗結果顯示凋亡細胞主要出現在DMD壞死和萎縮的肌纖維中(占76.67％)，明顯高于正常肌組織(P<0.05)，提示人類DMD肌纖維萎縮、壞死與凋亡的關系密切。劉曉蓉等研究表明，凋亡細胞隨著mdx鼠齡的增長而增加，推斷DMD的疾病進展可能與肌細胞的凋亡的增加有重要關系，而筆者的研究資料顯示3例終末期的DMD中未見明顯的凋亡小體，可能因為疾病終末期大部分肌纖維已經萎縮消失而被纖維脂肪組織取代，形成的凋亡小體于一定時間后大部分被巨噬細胞或鄰近的實質細胞吞噬、降解有關。在非終末期的DMD中，其病程長短與AI值未能發現有一定的相關性，而且由于觀察的病例不足以進一步分組，無法進行統計學處理，有待后續研究。
Caspase是細胞凋亡的核心環節，其級聯式激活并溶解蛋白質，決定了凋亡形態的變化。Caspase3是一種促凋亡因子，是Caspase系統引起細胞凋亡的下游成分，是細胞凋亡的效應分子。Caspase3通過破壞細胞核纖層，直接導致細胞結構的破壞。有資料表明Caspase3的活化在缺氧誘導的心肌細胞凋亡中起關鍵作用，但Tews等的研究結果正相反，在神經源性肌萎縮中未見Caspase3表達。本組資料顯示，在DMD中Caspase3陽性率為86.67％，主要分布在壞死和萎縮的纖維中，正常骨骼肌呈陰性表達，進一步證實在DMD中肌纖維的萎縮、壞死等改變與凋亡有關，并且存在著Caspase3的激活；資料還顯示Caspase3陽性率與病程長短呈正相關而與年齡無關，提示Caspase3的激活在DMD的肌肉損害中發揮作用。