高前進李壯志馬新東王瑞元
《北京體育大學學報》2005年10期
【摘要】：
隨著研究的逐漸深入和實驗技術的改進，人們對細胞骨架有了豐富的認識。細胞骨架包括微絲、微管和中等纖維，其在細胞中具有多種重要的生物學功能。
在骨骼肌細胞中細胞骨架按位置不同分為肌小節內、肌小節外和肌細胞膜骨架蛋白。
結蛋白desmin是骨骼肌細胞中主要的中等纖維，是重要的骨架蛋白。
整聯蛋白integrins和抗肌營養不良蛋白dystrophin復合物通過亞細胞膜分子和跨膜分子將骨骼肌的收縮成分與細胞外基質相連。
細胞骨架能穩定肌小節結構，由于肌節過度伸展或蛋白酶激活可能會損傷骨架蛋白。這些可能是運動訓練造成肌肉微損傷和骨骼肌疾病癥狀，例如肌營養不良癥的機制。
【關鍵詞】：骨骼肌；細胞骨架；結蛋白；抗肌營養不良蛋白
1、細胞骨架概述
細胞骨架按其功能性可下這樣的一個定義，即它們是負責細胞空間組織的結構。細胞骨架分為三種類型的蛋白質纖維，即微絲(microfilament)、微管(microtubule)和中等纖維(intermediatefilament)。它們分別是不同蛋白質以不同方式組裝成不同直徑的纖維。現在這些纖維蛋白質都能在體外解離和重新裝配，使得人們能夠對它們的化學性質進行分析。
微絲專指由肌動蛋白(actin)組成的、直徑約7nm的纖維。肌動蛋白和肌球蛋白(myosin)早已知是在細胞中更普遍，可能也是更主要的利用細胞化學能產生運動的機械-化學系統。所有的真核細胞都含有肌動蛋白，并且在多數細胞中，它是含量非常高的細胞質蛋白。肌球蛋白在肌肉細胞和非肌肉細胞中總是和肌動蛋白緊密相關的。其他一些結合蛋白可能與肌動蛋白相互作用使微絲表現出獨特的結構狀態，并使之能夠執行尤其多樣的功能，包括收縮和非收縮功能。
微管是直徑24～26 nm的管狀纖維，長度變化很大，常延伸到像纖毛、鞭毛或某些原生動物的軸偽足這樣一些長的細胞突起中。微管是由α和β管蛋白和少量微管結合蛋白的聚合作用而形成的。微管蛋白是構成微管的主要蛋白，它具有α和β兩型，兩個分子聯結在一起形成二聚體(dimers)，由它螺旋盤繞裝配成微管的壁。13個二聚體構成一周，因此在微管的橫切面上有13個原纖維。微管實際上是所有真核細胞的生活周期或發育史的某個時候在其細胞里找到的一種用途異常多的蛋白質聚合體，是真核細胞所僅有的普遍存在的結構。
中等纖維和微管、微絲，是構成細胞質骨架的三種主要纖維，在電鏡下呈直徑8～11nm的中空管狀。由于其直徑在微管和微絲之間，被命名為中等纖維。從細胞水平來看，中等纖維在細胞質內形成一個完整的支撐網架系統。它在外面與細胞膜和細胞外基質直接聯系，在內部與核表面利核基質直接聯系，中間與微管、微絲及其他細胞器聯系，因此在細胞內和細胞間都起著多方面的結構作用。
在細胞內，許多生物學上的過程需要有細胞骨架的參與。這包括有絲分裂、細胞運動、對細胞質的組織、細胞器在細胞內的運動、細胞形態的維持以及膜相關的諸多功能等。目前隨著生物學研究技術的不斷改進提高，使得細胞骨架的研究已從形態觀察為主，迅速推進到分子結構、功能利調節的研究。其豐富的研究成果及其在生物醫學領域中的重要性已使其成為了一個熱門研究領域。
2、骨骼肌細胞骨架概念及分類
骨骼肌細胞骨架由蛋白質構成，它的主要功能是聯結和錨定細胞內的結構成分。利用快速冷凍蝕刻技術可見，細胞質充滿長度利直徑不等的纖維，它們相互交聯成三維網狀結構，細胞骨架網中含有肌動蛋白纖維、微管和中間絲蛋白纖維，這些纖維的交聯方式非常復雜。核糖體、細胞器被錨定在細胞骨架上。
骨骼肌細胞骨架按位置不同可分類為肌小節內骨架、肌小節外骨架和肌細胞膜骨架。
Tinin和Nebulin是肌小節內的主要骨架蛋白，它們沿肌原纖維長軸排列在肌節內。Tinin從Z盤伸展到M帶，1983年Lashall等采用免疫電鏡初次發現tinin的定位，現在認為tinin是連接Z盤和Myosin之間的蛋白絲，從Z盤至M線，在肌節中具有一定的彈性，并維持Myosin的中間狀態。Nebulin在細胞中的定位是1988發現的，在肌肉放松的狀態下nebulin起源于Z盤，延伸至I帶，連接于Z盤與Z盤之間，與A帶中的actin平行排列，主要作用是保持actin的正常結構。
肌小節外細胞骨架主要由中等纖維(intermediatefilaments)組成，它位于肌原纖維周圍，連接Z盤、核膜和肌細胞膜之間。在骨骼肌細胞確認的一些中等纖維包括desmin、vimentin、nestin、synemin、paranemin、lamins andcytokeratins。然而，主要的肌肉特異性的中等纖維是desmin，其位于肌節Z盤周圍，連接相鄰的Z盤與肌細胞膜。
肌細胞膜骨架蛋白包括跨膜的和與膜相連的蛋白，例如vincullin、spectrin、dystrophin、integrins、ankyin等，這些蛋白將肌細胞內的肌原纖維和細胞外的基質間接地聯結起來，這種聯結是通過細胞膜上專門的區域costameres(肋小節)(圖1)。Costameres在肌細胞膜上呈周期性分布，costameres包含兩套細胞-基質相互作用受體復合物dystrophin-glycoprotein complex(DGC)和integins-talin、vinculin complex。Dystrophin-glycoprotein complex(DGC)是細胞膜上主要的具有重要功能的結構，也稱為dystrophin-associated protein complex(DAPC)。這個復合物是多分子的跨膜復合物，聯結細胞內骨架蛋白和細胞外基膜。由DGC調節的這種聯結對維持肌細胞完整性和肌力的產生起關鍵作用。DGC包含細胞外的和跨細胞膜的蛋白復合物α/β-dystroglycan、sarcoglycan的四個亞單位和sarcospan。α/β-dystroglycan是一個異源二聚體，與細胞外基質laminin-2相聯結。DGC復合物的跨膜成分與信號分子nNOS，dystrophin相聯。
DGC復合物基因變異可導致各種肌營養不良癥。例如，杜氏肌營養不良癥(DMD，Duchemae MuscularDystrophy)是由于缺乏dystrophin；貝克爾肌營養不良癥(BMD，BeckerMuscular Dystrophy)由于dystrophin以截短的形式表達；肢帶肌營養不良癥(LGMD，Limb-girdleMuscular dystrophies)，由于Sarcoglycans亞單位中的某一個變異所致。先天性基質肌營養不良癥(CMD，MerosinCongenital Muscular Dystrophy)由于基質中缺乏laminin-2所致(圖2)。由于DGC在人類骨骼肌疾病中有重要意義，因此DGC已成為眾多研究的焦點。在肌肉細胞膜結構中，DGC對維持神經-肌肉接觸點和肌肉-肌腱聯結點的成熟和穩定都發揮著重要作用。
在肌細胞膜上另一個關鍵性的結構是integrinsassociated to talin and vinculin complex。它與細胞基膜中laminin的各個亞型都有聯結，在細胞內與微絲相聯結。對細胞彼此之間的附著相當重要，還參與細胞信號轉導。
3、運動和骨骼肌細胞骨架蛋白
3．1 Desmin與骨骼肌微損傷機制
在骨骼肌細胞內除收縮蛋白以外，肌細胞還包括骨架蛋白。骨架蛋白在肌細胞內穩定和聯結收縮蛋白，使收縮產生的張力沿肌纖維長軸利肌纖維的側面傳遞。肌細胞內的骨架蛋白對預防骨骼肌離心收縮造成的損傷有重要作用。Desmin是細胞內結構利胞外基質聯結系統中的一個重要的蛋白，可能是離心收縮引起肌小節紊亂的重要機制。Desmin是位于Z盤周圍聯結Z盤和Z盤，同時將Z盤和肌細胞膜聯結到一起的結構蛋白，在穩定肌節結構和沿肌纖維各個方向傳遞張力的過程發揮重要作用。Lieber和Friden等在一組系列的研究中，使用免疫組織化學技術研究了Desmin可能發生的變化。在頭一個實驗中他們研究認為在一些肌纖維Desmin蛋白缺失是離心運動造成肌肉損傷的特點，而且Desmin蛋白丟失的肌細胞在損傷后即刻收縮蛋白結構正常。在第二個實驗中，Lieber等使用在兔后腿皮下植入電極刺激坐骨神經，使后腿產生離心收縮，觀察了兔脛骨前肌利趾長伸肌中desmin隨時間變化而丟失的情況，一開始的結構改變是5min后趾長伸肌(EDL)即有2．5％±0．63％的desmin標記丟失(P<0．05)，脛骨前肌(TA)丟失不明顯(0．24％±0．19％)，但是15min后，EDL利TA的desmin丟失率分別達到7．4±1．4％和4．6±1．0％(P<0．05)，第3 d時達到高峰，分別丟失30％以上和15％左右。Komulainen利用大鼠模型也發現運動后即刻和6h后desmin標記丟失。這些結果表明Desmin蛋白丟失可能是離心運動損傷的一個早期特點，這些Desmin染色陰性肌纖維后來很多都顯示出tinin染色增多和至后出現收縮蛋白降解變性。這些研究形成了對離心運動損傷機制的假說：
1)肌纖維被動過度伸展引發了肌細胞內鈣離子局部升高；這種增高可能是由于被動張力刺激張力敏感離子通道使該離子內流，或是由于肌漿網受損不能將鈣離子泵回肌漿網，或是由于T管系統或肌細胞膜受損所致。
2)細胞內升高的鈣離子激活蛋白酶，例如calpain，導致選擇型地中性蛋白水解，中等纖維網分解。已經證實Desmin是calpain的作用底物，而actin利myosin不是，這可以解釋為什么Desmin標記丟失的纖維收縮蛋白結構仍然完好。
3)至后由于蛋白酶水解作用使Desmin網被破壞，肌原纖維結構被破壞，不能產生正常的收縮力。
Belcastro也匯報了在跑臺跑后，大鼠后肢肌肉有增高的calpain活動。他認為先是機械外力引發肌細胞損傷，然后是肌細胞內鈣離子增多，導致后期的炎性反應。
3．2骨骼肌細胞膜骨架蛋白與肌肉微損傷機制
運動導致的肌肉酸痛(Exercise-inducemuscle soreness)肌肉微損傷(Exercise-induce mus-cle damage)是運動訓練和體育鍛煉中非常普遍的現象。Hough在1902年先建議運動導致的延遲性肌肉酸痛是由于肌纖維損傷引起。隨后，大量的研究認為，劇烈的、超過習慣負荷的運動(尤其包含離心收縮的運動)會使肌細胞結構、細胞外基質損傷，而且這種損傷伴隨著肌肉功能下降。組織學和超微結構觀察對肌細胞膜，肌原纖維和骨架蛋白的損傷提供了直接的證據。然而骨骼肌微損傷的機制仍然不清楚。目前對其損傷機制主要有幾種假說，如：
1)機械假說：在肌肉收縮和彈性成分中，由于高張力(尤其是伴隨離心收縮的)運動會造成結構的損害；
2)自由基攻擊假說，認為運動使氧自由基增加，脂質過氧化加強，從而使細胞膜受到攻擊損傷，進而肌細胞內容物漏出；
3)骨骼肌收縮蛋白和結構蛋白代謝平衡：胞漿鈣、線粒體鈣大量堆積，抑制細胞呼吸，造成氧化磷酸化的損害，使細胞內鈣進一步升高，激活鈣依賴蛋白水解酶，使Z線、肌蛋白酶和原肌球蛋白降解，對肌纖維結構造成了嚴重的損害。
以上幾種假說一致認為肌細胞膜損傷、肌細胞膜完整性的喪失是胞漿內容物泄漏和胞外鈣離子大量進入的直接原因。因此對骨骼肌細胞膜尤其是細胞膜骨架蛋白和膜上離子通道的研究引起了學者們的巨大興趣。Dystrophin是抗肌營養不良蛋白聚糖復合物(dystrophinglycoprotein complex DGC)的主要成分，DGC跨細胞膜連接著肌細胞內骨架蛋白和細胞外的基質。這種跨膜復合物的丟失、分解使收縮引起的肌纖維損傷大大增加，使肌細胞膜損傷導致肌纖維壞死。
Richard和DonatellaBiral用熒光免疫標記抗體的方法研究了離心收縮后骨骼肌細胞膜骨架蛋白(a-actinin、desmin、dystrophin、sarcoglycan、β-spectrin)和細胞間質蛋白(laminin，fibroneetin)的變化。在離心運動引起的損傷后，肌纖維之間有明顯的dystrophin標記丟失，而其它膜骨架蛋白受影響很小。說明dystrophin更易受到攻擊，并且其可能在力量傳遞中占有重要地位。
Sarcoglycan(肌聚糖蛋白)是一個多分布、位于膜上的蛋白聚糖復合物，與DGC相連。人類sarcoglycan基因變異引起肢帶肌肉營養不良癥(limb-girdle musclar dystrophy LGMD)；而Dystrophin基因變異引起杜氏或貝克爾肌營養不良癥(Duchenne/Becker muscular drstrophy DMD/BMD)。L．Feasson，D．Stockhohn等人應用蛋白免疫印跡分析法研究了離心運動引起的人肌細胞膜損傷的情況，發現離心收縮使a-sarcoglycan分解、丟失，Desmin沒有變化，運動后14d desmin合成增加有顯著性意義，而a-sarcoglycan14 d時蛋白水平仍然處于較低水平，作者還在此基礎上研究了小熱休克蛋白的表達情況，發現運動引起的Hsp27、aB-晶狀體蛋白表達逐漸增加，運動后1d蛋白表達達峰值，14d仍然處于較高水平與對照組相比有顯著差異。作者認為a-sarcogiycan屬于DGC復合物，對穩定肌細胞膜起重要作用，雖然a-sarcoglycan表達水平下降的準確意義不明，但是可以肯定其丟失是與內容物CK、LDH、肌球蛋白等的泄漏相關，此結果是與a-sarcoglycan基因敲除鼠表現出的肌膜完整性喪失，肌力下降，和顯著的DGC不穩定的結果相一致的。a-sarcoglycan蛋白水平的降低也可能調節細胞內鈣離子的濃度，因為，a-sarcoglycan有一個細胞外ATPase的活動，其減少時ATP酶增多，進而使P2X受體活動增強，P2X受體是一個非特異性的離子通道，a-sarcoglycan蛋白水平的下降可導致持續的P2X受體活動，而使胞內鈣超載。
以上的研究表明了膜骨架蛋白dystrophin和sarcoglycan在保持細胞膜完整性方面的重要性。這些骨骼肌細胞膜DGC復合物成份丟失發生在骨架蛋白desmin染色丟失之前或者發生在actin出現紊亂之前，因此這些蛋白復合物缺失可能有一個引發一系列損傷事件的源頭作用。對于接下來的肌原纖維再重建和預防下一次的離心運動損傷具有意義。
4、小結
運動性骨骼肌微損傷和延遲性肌肉酸痛多年來一直是運動醫學的研究熱點。細胞骨架遭到破壞可導致骨骼肌微損傷和延遲性肌肉酸痛，因為細胞骨架蛋白對維持肌節的正常結構起著非常重要的作用，運動過程中，高張力的機械牽拉會使細胞骨架的正常結構受到影響，從而造成肌肉收縮蛋白結構破壞。中間絲蛋白desmin和膜骨架蛋白復合物是骨骼肌中重要的骨架蛋白，是研究離心運動時骨骼肌細胞內部變化的敏感指標。目前對desmin在動物和人體上的實驗產生了不一致的觀察結果，因此有關人體的這方面的研究還需進一步深入。