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作者：鐘天映陳媛媛畢利軍
作者單位：中國科學(xué)院生物物理研究所結(jié)構(gòu)與分子生物學(xué)，北京，100101
刊名：生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展2009，36(10)
摘要：
三位美國科學(xué)家(Elizabeth H.Blackbum，Carol W.Greider和Jack W.Szostak)因發(fā)現(xiàn)“端粒和端粒酶是如何保護(hù)染色體的”獲得了2009年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，端粒是染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，對染色體有保護(hù)作用，而端粒酶能合成端粒，使得端粒的長度和結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)定，研究發(fā)現(xiàn)，端粒長度和端粒酶活性與細(xì)胞的壽命以及很多疾病發(fā)生直接相關(guān)。隨著研究的不斷深入，實現(xiàn)合理控制端粒的長度和端粒酶活性成為可能，這將有助于攻克醫(yī)學(xué)領(lǐng)域“癌癥、特定遺傳病和衰老”三個重要領(lǐng)域的難題，有望研究開發(fā)出潛在的新療法。
2009年10月5日，瑞典皇家科學(xué)院諾貝爾獎委員會宣布將2009年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(TheNobel Prizein Physiology or Medicine)授予3位美國科學(xué)家伊麗莎白·布萊克本(Elizabeth H．Blackburn)，卡蘿爾·格雷德(Carol W．Greider)和杰克·紹斯塔克(Jack W．Szostak)，以表彰他們“發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶是如何保護(hù)染色體的”。在染色體的末端部分有一個像帽子一樣的特殊結(jié)構(gòu)，這就是端粒(圖1)。Blackburn和Szostak發(fā)現(xiàn)端粒的一段特殊DNA序列能使染色體不被降解，而Greider和Blackburn則找到了幫助端粒合成的分子——端粒酶。他們的發(fā)現(xiàn)闡明了端粒酶的作用——使端粒的長度和結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)定，從而保護(hù)染色體。細(xì)胞隨著端粒的變短而衰老，而當(dāng)端粒酶的活性足以維護(hù)端粒的長度時，細(xì)胞將會延遲衰老。在癌細(xì)胞獲得永生性這一過程中，端粒酶的激活起了非常重要的作用。相反，一些遺傳病正是由于端粒酶的活性缺陷將導(dǎo)致細(xì)胞的損傷。正是由于三位科學(xué)家的開創(chuàng)性工作讓人們知道端粒和端粒酶不僅與染色體的特質(zhì)和穩(wěn)定性密切相關(guān)，而且還涉及細(xì)胞的衰老與損傷、癌癥的發(fā)生等方面。
1端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)與功能研究
對端粒的研究可追溯到20世紀(jì)70年代初對DNA聚合酶特性的深入研究引申出的一個染色體復(fù)制問題。研究發(fā)現(xiàn)，染色體并沒有隨著復(fù)制后RNA引物的降解而縮短，其自然末端也沒有相互融合，這些都暗示可能存在一個特殊的結(jié)構(gòu)來避免染色體縮短和相互融合的發(fā)生。在逐漸明晰了染色體末端特殊結(jié)構(gòu)的概念之后，人們給了它一個專有名稱——端粒(telomere)。其實早在20世紀(jì)30年代，諾貝爾獎得主Hermnn Muller和Barbara Mcclimock已經(jīng)觀測到染色體的末端結(jié)構(gòu)在避免染色體之間的融合中起了重要的作用，從而猜測它可能有保護(hù)染色體的作用。1978年，Blackburn發(fā)現(xiàn)了富含小染色體的模式生物四膜蟲的端粒含有許多重復(fù)的5’-CCCCAA-3’六堿基序列，與此同時，Szostak發(fā)現(xiàn)微型染色體在導(dǎo)入酵母后會很快被降解這一現(xiàn)象，于是這兩位科學(xué)家將四膜蟲的CCCCAA序列偶聯(lián)到微型染色體上并導(dǎo)入酵母，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這段端粒序列的加入使得微型染色體免受降解，從而證實了端粒對染色體的保護(hù)作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，端粒可通過形成t-loop緊湊結(jié)構(gòu)，或者與Shelterin等端粒保護(hù)蛋白結(jié)合，從而防止染色體降解、避免末端融合，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞生長。隨著體細(xì)胞的不斷增殖，端粒會逐漸縮短(圖2)，當(dāng)端粒縮短至一定程度，細(xì)胞停止分裂，進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)，故有人稱端粒為正常細(xì)胞的“分裂鐘”(mistosis clock)。端粒DNA序列既有高度的保守性，如原生動物、真菌、高等植物及高等動物中期序列都很相似，又有種屬特異性，如四膜蟲重復(fù)序列為GGGGTT，草履蟲為TTGGGG，人類和哺乳動物為TTAGGG。
在1984年報道酵母端粒序列的同時，Blackburn實驗室發(fā)現(xiàn)了一個有趣的現(xiàn)象：帶著四膜蟲端粒DNA的人工染色體導(dǎo)入到酵母后，被加上了酵母的端粒而不是四膜蟲的端粒序列。由于端粒是由重復(fù)序列組成的，當(dāng)時人們普遍猜想同源重組是延伸端粒、補(bǔ)償染色體末端隱縮的機(jī)制。但是同源重組只能復(fù)制出更多自身的序列，為什么在四膜蟲端粒上加的是酵母的端粒序列而不是四膜蟲端粒本身的序列呢?難道酵母中存在專門的“酶”來復(fù)制端粒DNA?隨后，Blackburn實驗室用四膜蟲的核抽提液與體外的端粒DNA進(jìn)行溫育，證明確實存在一種“酶”能延伸端粒DNA，這種酶后來被命名為“端粒酶”(telomerase)。之后，Morin從人宮頸癌細(xì)胞株HeLa中鑒定了端粒酶的存在，并證實它是一種核糖核蛋白。端粒酶通過引物特異識別位點，以自身RNA為模板，在染色體末端合成端粒DNA，使端粒得以延長，為后續(xù)DNA聚合酶合成完整的染色體提供了平臺(圖3)。
人類端粒酶主要由RNA成分(hTR)、端粒酶相關(guān)蛋白1(hTEP1)和催化亞單位(hTERT)三部分組成。hTR長約560 nt，其中有11個堿基(5’-CUAACCCUAA-3’)與人類端粒序列5’TTAGGG-3’互補(bǔ)。與此區(qū)互補(bǔ)的反義寡核苷酸能抑制端粒酶活性，而這段RNA的突變會導(dǎo)致端粒酶活性的改變。hTEP1的mRNA表達(dá)并不限于有端粒酶活性的組織和細(xì)胞系，各組織的水平差異與端粒酶的活性無關(guān)，因此，端粒酶活性表達(dá)并不是由TEP1決定的，但hTERT則是端粒酶活性所需要的。作為RNA依賴的DNA聚合酶，區(qū)別于一般的蛋白逆轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶，hTERT可識別單鏈富含G的寡核苷酸引物，以其RNA組分的堿基為模板與端粒重復(fù)序列進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對，在合成、延伸堿基序列中起催化作用。Skordalakes和同事克隆了赤擬谷盜(Tribolium castaneum)的端粒酶TERT并收到了三維晶體結(jié)構(gòu)。如圖4所示，TERT的晶體結(jié)構(gòu)由三部分組成：RNA結(jié)合區(qū)(TRBD)、逆轉(zhuǎn)錄區(qū)(the reverse transcriptasedomain)和羧基末端延伸區(qū)(carboxy-terminalextension，CTE)。TRBD主要由螺旋組成，含有CP和T兩個保守區(qū)域，與單鏈和雙鏈RNA結(jié)合。逆轉(zhuǎn)錄區(qū)由α螺旋和β折疊組成，呈現(xiàn)像手指(Fingers)和手掌(Palm)形狀的結(jié)構(gòu)。而CTE區(qū)由延長的螺旋組成，其表面有長的loop結(jié)構(gòu)，這種新的二級結(jié)構(gòu)折疊方式使CTE區(qū)成為TERT的“拇指”(Thumb)。此研究結(jié)果為揭示TERT與RNA合作合成DNA的過程提供了重要的結(jié)構(gòu)信息，為根本性理解端粒酶及其潛在的醫(yī)療應(yīng)用邁出了重要的一步。
2端粒與細(xì)胞衰老
細(xì)胞的復(fù)制期限被認(rèn)為是由導(dǎo)致衰老的兩個機(jī)制決定，一個是累積的DNA損傷，另一個是端粒的進(jìn)行性縮短。1973年，Olovnikov先提出關(guān)于端粒丟失同衰老的關(guān)系理論，認(rèn)為由于末端復(fù)制而造成的端粒丟失很可能調(diào)節(jié)了細(xì)胞的壽命。Bodnar等通過激活端粒酶的活性，使端粒得以延長，從而延長了人類正常細(xì)胞的生命周期，有力證實了端粒與衰老的關(guān)系。在Werner綜合癥(一種罕見的人類早衰疾病)的研究中，已有多個證據(jù)表明了端粒異常與其緊密相關(guān)。Crabbe等認(rèn)為，端粒異常是WRN細(xì)胞基因組不穩(wěn)定的原因之一。Stewart的研究結(jié)果表明，是端粒單鏈懸垂的侵蝕而非整個端粒長度的變化，導(dǎo)致了衰老這種狀態(tài)。Michishita等研究了人類SIRT6，一種具有乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性的染色質(zhì)相關(guān)蛋白，它可調(diào)節(jié)端粒染色質(zhì)，其缺失導(dǎo)致的異常端粒結(jié)構(gòu)與Wemer綜合癥中的特征相似。端粒與衰老研究的不斷深入，為進(jìn)一步了解衰老的分子機(jī)制，提供了重要的線索。
3端粒與DNA損傷應(yīng)答
真核線性染色體端粒的化學(xué)構(gòu)成和染色體內(nèi)的損傷、斷裂DNA十分相似，然而DNA修復(fù)機(jī)器卻能夠?qū)烧邊^(qū)分，其中與端粒結(jié)合的Shelterin蛋白復(fù)合物起了關(guān)鍵的作用。Shelterin是由6個蛋白質(zhì)——TRF1、TRF2、TIN2、RAP1、TPP1和POT1，組成的復(fù)合物，可使端粒DNA不被DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response，DDR)所識別。其中，蛋白TRF2和POT1l分別抑制由ATM和ATR介導(dǎo)的DDR途徑，從而避免應(yīng)答的發(fā)生。隨著細(xì)胞的分裂，端粒逐漸變短，當(dāng)縮短到一定程度時，將會激活A(yù)TM和ATR介導(dǎo)的DDR途徑，細(xì)胞死亡或進(jìn)入衰老。
然而，許多研究表明，與DNA損傷應(yīng)答相關(guān)的蛋白質(zhì)出現(xiàn)在端粒上，并直接或間接參與端粒的維護(hù)。DNA雙鏈斷裂修復(fù)蛋白的缺陷，如ATM、Ku、DNA-PKcs、RAD51D、MRN復(fù)合物的缺陷，會導(dǎo)致端粒的錯誤代謝。因此，功能性端粒需要和DDR修復(fù)蛋白相互作用。總體來說，現(xiàn)在觀察到的端粒和DNA損傷修復(fù)途徑存在著兩極關(guān)系。一方面，正常端粒需要避免DNA損傷應(yīng)答的激活。另一方面，端粒復(fù)制和保護(hù)又需要DDR相關(guān)蛋白的參與。
4端粒與腫瘤發(fā)生
正常情況下人類體細(xì)胞端粒酶的檢測結(jié)果是陰性的，但在400個腫瘤樣品中，85％以上能檢測到端粒酶的存在。細(xì)胞的端粒酶活性因某些原因被激活，使端粒不斷維持在一定的長度，細(xì)胞因此逃過死亡而成為無限增殖的細(xì)胞——腫瘤細(xì)胞。端粒酶活性與惡性腫瘤的這種密切關(guān)系，為腫瘤的診斷提供了有效的標(biāo)志物。端粒酶是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞的關(guān)鍵性物質(zhì)，是抗腫瘤治療的重要靶點。而且，正常細(xì)胞與腫瘤組織中端粒酶的表達(dá)、端粒的長度和細(xì)胞動力學(xué)的差異，使得選擇端粒酶作為藥物靶標(biāo)成為相對平安的治療手段。通過抑制端粒酶活性來治療腫瘤的研究進(jìn)展迅速，其中長度為13-mer的寡核苷酸GRN163能與人類端粒酶RNA亞單位hTR互補(bǔ)結(jié)合，從而抑制端粒酶與端粒的結(jié)合，達(dá)到抑制端粒酶活性的效果，已經(jīng)被應(yīng)用于臨床。
5端粒與干細(xì)胞功能
端粒酶的表達(dá)對于維持干細(xì)胞自我更新能力和復(fù)制潛能具有重要意義。伴隨器官的老化，端粒縮短，而端粒酶的功能缺失突變又會加劇端粒縮短。造血干細(xì)胞在表達(dá)端粒酶的情況下，隨著年紀(jì)的增長其端粒仍然會丟失，但B細(xì)胞和T細(xì)胞的激活能上調(diào)端粒酶的活性，從而減少端粒的侵蝕甚至使端粒延長。患有先天性角化不良(dyskeratosis congenkal，DC)、特發(fā)性肺纖維化(idiopathicpulmonary fibrosis，IPF)和再生障礙性貧血(aplasticanemia)的病人其端粒酶發(fā)生突變會導(dǎo)致組織器官更新能力的過早喪失，其壽命也因此縮短。這些現(xiàn)象均表明端粒長度和端粒酶活性與干細(xì)胞的細(xì)胞周期緊密聯(lián)系，且直接影響干細(xì)胞的分化和自我更新的能力。
6展望
三位科學(xué)家的發(fā)現(xiàn)使我們了解到端粒不僅與染色體的個性特質(zhì)和穩(wěn)定性密切相關(guān)，而且還涉及細(xì)胞的壽命、衰老與死亡等等。同時我們也應(yīng)認(rèn)識到端粒和染色體等雖然與細(xì)胞老化有關(guān)，進(jìn)而影響衰老，但并非僅有的因素，“生命衰老是一個非常復(fù)雜的進(jìn)程，它有許多不同的影響因素，端粒僅僅是其中之一”。端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)是有關(guān)人類衰老、癌癥和干細(xì)胞等研究的謎題拼圖中重要的一片，此發(fā)現(xiàn)使我們對細(xì)胞的理解增加了新的維度，清楚地顯示了疾病的機(jī)理，并將促使我們開發(fā)出潛在的新療法。
盡管已有越來越多的有關(guān)端粒與端粒酶的研究成果，但這一領(lǐng)域仍然存在著不少有待解決的問題。端粒與端粒保護(hù)蛋白質(zhì)之間是如何相互協(xié)調(diào)從而維持端粒的結(jié)構(gòu)；究竟是由于端粒縮短到一定程度還是某些特異的末端結(jié)構(gòu)導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定性；正常的發(fā)育過程中端粒酶是如何調(diào)控，而在腫瘤細(xì)胞中又是怎樣被激活的。隨著研究的不斷深入，端粒維護(hù)的機(jī)制將被更完善地闡述，針對衰老、癌癥、遺傳病的治療方法也會有進(jìn)一步的改進(jìn)。