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陶丁瞿寧厚王純
《現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)》2009年21期
【作者單位】：四川省人民醫(yī)院皮膚外科；成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)系；
【摘要】：
[目的]
探討大鼠骨骼肌缺血再灌注后不同時(shí)相肌細(xì)胞Bax基因蛋白表達(dá)的變化。
[方法]
用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)并觀察大鼠右后肢止血帶缺血再灌注后4h、24h、48hBax基因蛋白在肌細(xì)胞中的表達(dá)情況；均以同組大鼠左后肢腓腸肌作自身對(duì)照。
[結(jié)果]
缺血再灌注后4h肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)Bax蛋白表達(dá)，其陽性表達(dá)率為(5.97±1.44)%；
缺血再灌注后24h，肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)的陽性率為(18.45±1.81)%；
缺血再灌注后48的肌細(xì)胞則未見Bax蛋白的表達(dá)；
所有各組左后肢肌細(xì)胞內(nèi)亦無Bax蛋白的表達(dá)。
統(tǒng)計(jì)分析表明，缺血再灌注后24h組較之4h組、48h組以及實(shí)驗(yàn)自身對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)。
[結(jié)論]
本實(shí)驗(yàn)研究表明，缺血再灌注損傷的肌細(xì)胞中有促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因Bax蛋白的陽性表達(dá)，其陽性表達(dá)率與缺血再灌注不同時(shí)相密切相關(guān)，以24h組更為顯著，此時(shí)病理損害亦更為顯著，提示Bax基因促發(fā)的細(xì)胞凋亡可能是骨骼肌缺血再灌注損傷病理機(jī)制中的一個(gè)組成部分。
肢體缺血是臨床常見的情況，恢復(fù)其血液循環(huán)是挽救缺血肢體的必須前提，而且血液循恢復(fù)得越早越好，這即所謂的再灌注。但是再灌注有時(shí)不但不能使缺血肢體恢復(fù)正常，反而會(huì)加重局部的代謝紊亂、功能障礙、甚至結(jié)構(gòu)損傷，這即是缺血再灌注的局部損傷。再灌注損傷是Jennigs(1960)率先提出的。以后的工作證實(shí)，再灌注損傷作為一種普遍的病理生理過程存在于多種組織器官。肢體缺血時(shí)間的長(zhǎng)短，不僅決定再灌注局部損傷的嚴(yán)重程度和是否能引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，甚至遠(yuǎn)隔的多臟器功能障礙，其中肺是易受損的首位靶器官，表現(xiàn)為急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，肢體缺血時(shí)間的長(zhǎng)短還可決定其是否存活。
肢體缺血的再灌注損傷主要是指骨骼肌的再灌注損傷，見于擠壓綜合征、骨筋膜室綜合征、止血帶和石膏、小夾板固定的錯(cuò)誤使用、斷肢再植等。目前更關(guān)注對(duì)其所致急性肺損傷的作用和機(jī)制的探討，而對(duì)再灌注損傷肢體的研究不多。近年發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡參與了再灌注損傷的病理過程并扮演重要角色。那么在肢體缺血再灌注損傷中，骨骼肌細(xì)胞凋亡是否也參與其中?這方面報(bào)告很少，而且結(jié)論迥異。究竟如何，值得我們進(jìn)一步研究。
1材料和方法
1．1動(dòng)物、材料和缺血再灌注損傷模型建立及大鼠分組
1．1．1試驗(yàn)成年大鼠18只(由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，雌雄不限，體重300～350g，常規(guī)喂養(yǎng)，活動(dòng)正常，質(zhì)量合格。
1．1．2檢測(cè)所用Bax蛋白即用型試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購自美國(guó)Santacruz公司，其他試劑均系四川省人民醫(yī)院病理科提供。
1．1．3缺血再灌注損傷動(dòng)物模型的建立是按臨床骨科膝關(guān)節(jié)手術(shù)時(shí)，先行驅(qū)血和在大腿上止血帶的方法模擬而成。具體方法是用3％戊巴比妥鈉對(duì)試驗(yàn)鼠進(jìn)行腹腔麻醉后，將其右后肢先用橡皮帶驅(qū)血，再用止血帶環(huán)扎于膝關(guān)節(jié)以上盡可能高的部位，其張力以恰好阻斷血供為度(該肢體蒼白，針刺無出血)，應(yīng)用時(shí)間為1．5h。
1．1．4試驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組(n=6)，即缺血再灌注后4h組、缺血再灌注后24h組和缺血再灌注后48 h組，以同組大鼠左后肢腓腸肌作自身對(duì)照(試驗(yàn)對(duì)照組)。
1．2方法
1．2．1病理學(xué)檢查
將實(shí)驗(yàn)大鼠頸部脫臼處死，取腓腸肌常規(guī)固定，制片，片厚5μm。切片HE染色，分別觀察切片的組織學(xué)、病理學(xué)表現(xiàn)。
1．2．2免疫組化檢測(cè)
試驗(yàn)方法和步驟按Bax蛋白即用型試劑盒的說明書進(jìn)行。
1．2．3凋亡
肌細(xì)胞的判定標(biāo)準(zhǔn)上述免疫組化處理之切片，光鏡下凡肌細(xì)胞漿內(nèi)有棕黃色著染者為Bax蛋白表達(dá)陽性，是為凋亡細(xì)胞。每張切片在400倍光學(xué)鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)肌細(xì)胞中的陽性細(xì)胞，計(jì)算其百分率。
1．2．4陽性對(duì)照
取對(duì)Bax蛋白表達(dá)強(qiáng)陽性的大鼠正常結(jié)腸組織作上述免疫組化染色，以切片內(nèi)對(duì)Bax蛋白表達(dá)陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞為凋亡細(xì)胞陽性對(duì)照。
1．2．5陰性對(duì)照
撤除Bax蛋白單抗，其他同1．2．3。
1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
所得數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，采用SPSS10．0統(tǒng)計(jì)軟件，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2．1病理學(xué)及免疫組化觀察檢測(cè)結(jié)果
2．1．1所有實(shí)驗(yàn)大鼠自身對(duì)照側(cè)的腓腸肌均顯示正常肌組織，肌細(xì)胞形態(tài)正常，胞漿內(nèi)橫紋清楚，細(xì)胞間結(jié)合緊密。免疫組化檢測(cè)未見可判斷為Bax蛋白陽性表達(dá)的肌細(xì)胞。
2．1．2缺血再灌注后4h組腓腸肌有不同程度的充血水腫，切面有血性液體溢出。鏡下見肌纖維有程度不一的水腫，局限性肌纖維紊亂，甚至消失，肌間質(zhì)充血、滲液，小動(dòng)靜脈充盈，可見中性粒細(xì)胞貼壁并浸潤(rùn)至肌間隙，偶見壞死崩解的肌細(xì)胞液片狀外漏。免疫組化檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)散在肌細(xì)胞漿內(nèi)有Bax蛋白表達(dá)，其陽性表達(dá)率為(5．97±1．44)％。
2．1．3缺血再灌注后24h組鏡下可見肌間出血，滲液明顯增多，大量中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)血管壁增厚，有血栓形成，肌束內(nèi)見散在的肌細(xì)胞漿內(nèi)橫紋消失，呈斑紋樣或空泡樣改變，核消失。免疫組化檢測(cè)，Bax蛋白陽性表達(dá)的肌細(xì)胞明顯增多，但其細(xì)胞形態(tài)完整核致密或核消失，胞漿內(nèi)有斑紋樣或空泡樣改變。Bax蛋白陽性表達(dá)的肌細(xì)胞占計(jì)數(shù)肌細(xì)胞的(18．45±1．81)％。
2．1．4缺血再灌注后48 h組腓腸肌充血水腫程度有所減輕，切面血性滲出明顯減少。鏡下見肌間質(zhì)出血、滲液、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及肌纖維水腫均有所減輕，肌細(xì)胞間結(jié)合較松散，肌細(xì)胞核增多。免疫組化檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)有意義的Bax蛋白陽性表達(dá)的肌細(xì)胞。
2．2數(shù)據(jù)處理結(jié)果
實(shí)驗(yàn)對(duì)照組缺血再灌注后48h組的大鼠骨骼肌細(xì)胞均無有意義的Bax蛋白陽性表達(dá)，其陽性表達(dá)率視為0；缺血再灌注后4h組肌細(xì)胞Bax陽性表達(dá)率為(5．97±1．44)％：缺血
再灌注后24 h組肌細(xì)胞Bax蛋白陽性表達(dá)率為(18．45±1．81)％。后者較之實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、缺血后再灌注后4h和缺血再灌注后48h差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。
3討論
本文所見的骨骼肌缺血再灌注損傷的光鏡下表現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)告相符，應(yīng)該指出，動(dòng)物下肢以止血帶缺血在2～3 h之內(nèi)，一般不會(huì)造成整個(gè)缺血肢體不可逆損害。
3．1缺血再灌注損傷發(fā)生的機(jī)制
如Pack等所強(qiáng)調(diào)的，即缺血再灌注損傷發(fā)生根本的機(jī)制是氧自由基的大量產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)鈣超載以及隨之而來的微血管功能障礙。再灌注時(shí)，Ca2+大量?jī)?nèi)流激活了磷脂酶，降解膜磷脂，導(dǎo)致膜損害、脂質(zhì)過氧化以及破壞細(xì)胞骨架并引發(fā)中性粒細(xì)胞的激活和浸潤(rùn)；通過呼吸暴發(fā)釋放了大量的氧自由基(這與黃嘌呤氧化酶在再灌注時(shí)的活性過度增加有關(guān))，蛋白水解酶及炎癥介質(zhì)引發(fā)或加重細(xì)胞損傷，氧自由基還有細(xì)胞毒作用。在這些因素綜合作用下，在微血管內(nèi)中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相互黏附作用明顯增加，其結(jié)果是造成微血管功能障礙并滅活一氧化氮(NO)。晚近的研究發(fā)現(xiàn)核因子-κB(NF-κB)和活化蛋白-1(Ap-1)這兩個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子及其下游的促炎癥細(xì)胞因子如TNF-α和IL-6等在心肌缺血再灌注損傷期間的顯著表達(dá)，提示它們?cè)谌毖俟嘧p傷發(fā)生中的關(guān)鍵作用，這對(duì)骨骼肌缺血再灌注損傷的研究具有一定的意義。
3．2關(guān)于細(xì)胞凋亡
3．2．1細(xì)胞死亡形式不止一種，已知的有壞死、凋亡以及有絲分裂細(xì)胞死亡(mitoticcell death)，后者又稱“有絲分裂災(zāi)難”(mitoticcatas-trophe)，是近年發(fā)現(xiàn)的，經(jīng)過有絲分裂的死亡方式，它與細(xì)胞分裂過程受阻有關(guān)。Majno 1995提出脹亡(oncosis)的概念，現(xiàn)認(rèn)為這是細(xì)胞壞死的早期表現(xiàn)，不是獨(dú)立的細(xì)胞死亡方式。對(duì)3種死亡形式的研究，以對(duì)細(xì)胞凋亡的研究更受重視，并取得令人滿意的進(jìn)展，其研究成果已應(yīng)用于臨床。
細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控的，是為維護(hù)機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的自主性死亡；是為適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境變化，維護(hù)正常生長(zhǎng)發(fā)育、正常生理狀況和功能，消除無功能甚至是有害細(xì)胞所必須的，這在胚胎發(fā)育中尤為重要，因之具有重大的生物學(xué)意義。細(xì)胞凋亡過程是以胞核DNA片段化裂解為特征，是一耗能的主動(dòng)過程，有賴于mRNA和蛋白質(zhì)的新合成。
缺血再灌注損傷時(shí)，不足引發(fā)壞死但又不可能恢復(fù)的肌細(xì)胞選擇了凋亡。對(duì)其要一分為二，負(fù)面影響是減少肌組織的實(shí)質(zhì)成分，但也看到其正面作用，即不會(huì)像細(xì)胞壞死那樣產(chǎn)生“次級(jí)損傷”，即不會(huì)引發(fā)周圍組織的炎癥和免疫反應(yīng)，這是有利的。
3．2．2缺血再灌注損傷肌細(xì)胞凋亡的誘發(fā)機(jī)制
哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡途徑有二，即線粒體途徑(胞內(nèi)途徑)與死亡受體途徑(胞外途徑)。其中天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶(半胱天冬酶，Caspases)家族在這兩條途徑中都起著非常主要的作用。缺血再灌注損傷引發(fā)的細(xì)胞凋亡，與氧自由基的大量產(chǎn)生、鈣超載、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(MPTP)開放，一氧化氮(NO)的減少和鉀通道阻滯有關(guān)，更與上面提到的半胱天冬酶的活化直接有關(guān)，也與某些細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)。近期的工作表明，核因子NF-κB是一組調(diào)控凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子?？梢?，引發(fā)缺血再灌注損傷的機(jī)制可能即是導(dǎo)致此時(shí)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
3．2．3缺血再灌注時(shí)細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控很復(fù)雜，本文僅就凋亡Bcl基因大家族的Bax及bcl-2進(jìn)行討論。bcl-2屬抗凋亡亞族，這一亞族中還有很多其他成員。bcl-2等對(duì)維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整性起重要作用，它可增加線粒體內(nèi)質(zhì)子的外排，調(diào)節(jié)線粒體通透性粒轉(zhuǎn)換孔道，阻止C-myc(一種原癌基因)介導(dǎo)的凋亡，抑制與還原型谷胱甘肽含量下降相關(guān)的凋亡。bcl-2蛋白分子C端的羧基具有疏水性，含有一個(gè)由19個(gè)氨基酸伸展形成的跨膜結(jié)構(gòu)，常位于線粒體膜。這一特點(diǎn)與bcl-2調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的方式和能力非常有關(guān)。Bax則屬促凋亡亞族(又稱原凋亡亞族)的代表，同樣這一亞族中還有許多其他成員。它可促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bax與bcl-2既可構(gòu)成異源二聚體，也可自身組成同源二聚體，這取決于bcl-2和Bax之間的比例。異源二聚體占優(yōu)勢(shì)時(shí)，有利于細(xì)胞存活。Bax同源二聚體占優(yōu)勢(shì)時(shí)，則趨于凋亡。無死亡信號(hào)時(shí)，促凋亡基因以無活性形式分布于胞液或細(xì)胞骨架，抗凋亡基因作為細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的一部分被隔離。此時(shí)，兩者均無行動(dòng)，不起作用。在缺血再灌注損傷時(shí)，有死亡信號(hào)發(fā)生，兩者均開始行動(dòng)，一旦Bax的表達(dá)占優(yōu)勢(shì)即可組成Bax同源二聚體，抑制了bcl-2的抗凋亡作用促進(jìn)了肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究表明，缺血再灌注后24h組的肌細(xì)胞有顯著Bax蛋白高表達(dá)，與bcl-2比例發(fā)生改變，組成Bax同源二聚體，從而抑制了bcl-2的抗凋亡作用，清除了難以修復(fù)的肌細(xì)胞。金旭紅等認(rèn)為，制動(dòng)導(dǎo)致骨骼肌萎縮之所以有明顯的細(xì)胞發(fā)生凋亡，可能是由于廢用以及固定引起的相對(duì)缺血缺氧所致。這與缺血再灌注損傷所致的肌細(xì)胞凋亡有一定的相似之處，因?yàn)槿毖毖蹩蓪?dǎo)致線粒體損傷，而線粒體在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)道路中起著十分重要的作用，前已述及，茲不再贅。在上述可能的諸多因素作用下，復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)失調(diào)，繁雜的凋亡調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)失控，從而發(fā)生肌細(xì)胞凋亡。但是正如bcl-2與Bax之間的關(guān)系失衡進(jìn)而決定細(xì)胞是死是活的機(jī)制十分復(fù)雜，有待深入的研究。
本研究顯示，缺血再灌注損傷所致的細(xì)胞凋亡同樣可以發(fā)生在骨骼肌組織，而且肌細(xì)胞凋亡的程度與缺血再灌注不同時(shí)相有關(guān)，以再灌注后24h更為明顯。如何來防治缺血再灌注損傷，已引起國(guó)內(nèi)外的廣泛注意，特別應(yīng)重視缺血預(yù)處理的臨床應(yīng)用研究，以挽救更多的缺血肢體。
(致謝：四川省人民醫(yī)院病理科楊紅老師在免疫組化工作中給子大力協(xié)助，特此感謝。)
(收稿日期：2008-11-24)