凌今，凌人，黃彬彬，葉煒劍，叢維濤，金利泰
中國醫藥生物技術2013年4月第8卷第2期
作者單位：325035，溫州醫學院藥學院蛋白質組學中心(凌今、黃彬彬、葉煒劍、叢維濤、金利泰)；
321000浙江金華廣福醫院病理科(凌人)；
321000浙江金華市人民醫院藥劑科(凌今)
收稿日期：2012-11-30
短暫的缺血會對器官造成損傷，但是在恢復灌注后，損傷反而進一步加劇，這種現象稱為缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)。臨床上涉及缺氧/復氧過程的手術都不可避免地會發生IRI，比如重大器官的移植、冠脈搭橋、溶栓術等。IRI一直是醫學研究的熱點，近年來研究發現，缺血再灌注(ischemiareperfusion，IR)時，鈣超載、供能不足和氧自由基的大量產生等理化因素刺激細胞，誘發信號介導的細胞損傷、凋亡是造成IRI的一個重要原因。本文就IRI與信號通路的研究進展做簡要綜述。
1缺血再灌注損傷
缺血時器官以無氧酵解方式呼吸供能，胞內累積大量乳酸，pH下降。再灌注時，細胞為了恢復正常的pH水平，泵入Na+以交換H+，但Na+過量引發了Ca2+內流，迅速升高的Ca2+造成細胞鈣超載，導致死亡。過量生產的活性氧(reactiveoxygen species，ROS)在IRI的發生發展中起著至關重要的推動作用，即使在臨床手術時應用抗氧劑，其損傷往往也難以有效遏制。缺血發生時，細胞降低代謝水平來適應供能供氧不足的情況，再灌注時，細胞代謝水平迅速恢復正常，但氧化供能短時間無法滿足其需求，這也是造成細胞損傷的又一原因。功能細胞是器官的關鍵組成，代謝非常活躍，因而易受到致命的影響。功能細胞的大量死亡宏觀表現為器官的功能障礙，暫時或長久性的功能障礙即缺血再灌注損傷。
2細胞信號轉導
生物體是由一群具有特殊結構與功能的細胞并由細胞膜組成的復雜有機體，其內的大分子、細胞器、細胞、組織和器官在空間上是相互隔離的，且大多數細胞不與外界環境直接接觸，因此多細胞生物對外界的刺激(包括物理、化學、生物因素)需要細胞間復雜的信號轉導系統通過級聯系統傳遞，從而調控機體內功能各異細胞的新陳代謝和行為，以保證整體生命活動的正常進行。可以說，所有重要的生命現象都與細胞內信號轉導有關。細胞信號轉導通常是指細胞通過細胞表面受體接受外界信號，通過系統級聯傳遞機制，將細胞外信號轉導為胞內信號，引起細胞生理反應或誘導特定基因的表達，引起細胞的應答反應。病理狀態下，細胞的信號轉導發生改變，其中一部分級聯信號激活自身防御及代償機制，提高機體對疾病的抗性；另一部分信號則誘發細胞代謝紊亂，介導細胞凋亡，促進疾病的發生發展。因此，探究疾病狀態下信號轉導變化，可以為臨床治療開辟一條嶄新的道路。
3缺血再灌注的病理生理學特點
在病理條件下，冠脈閉塞15～20 s，糖酵解隨即成為高能磷酸化供能的僅有方式。雖然短時間內可以維持心肌細胞的基礎能量需求，但是當缺血時間延長至60～90 min時，提供ATP的無氧酵解過程基本停滯，細胞幾無能量供應，梗死面積逐步擴大，心臟攣縮。
再灌注時，心臟的能量需求恢復，然而功能的恢復卻相對滯后，緩慢地達到缺血前的狀態，這個現象被稱為心肌鈍抑。鈍抑的心肌往往消耗大，做功少，效率低下。這主要是因為在再灌注時脂肪酸氧化、糖酵解和丙酮酸氧化速率大幅升高。高速率的脂肪酸β氧化很大地抑制了葡萄糖氧化，致使葡萄糖氧化和糖酵解水平失衡。血漿內的高濃度游離脂肪酸可進一步抑制丙酮酸的氧化。如果糖酵解與葡萄糖氧化偶聯，那么糖酵解不產生H+。然而如果糖酵解不與葡萄糖氧化偶聯，丙酮酸則酵解生成乳酸，這個過程中由于ATP的水解，每個葡萄糖分子凈生成2個H+。這種葡萄糖氧化和酵解的解耦合作用是心臟內H+的主要來源。代償供能產生的H+蓄積于細胞內，再灌注時細胞會把Na+泵入胞內，置換出H+，從而恢復pH值到正常水平。Na+的大量流入刺激了細胞內的Na+與細胞外的進行Ca2+交換，Na+/Ca2+的交換效率很高，細胞內Ca2+很快出現超載現象，導致了細胞的死亡。
基于上述細胞代謝的研究發現，線粒體膜上非選擇性的通道——線粒體通透性轉換孔(mPTP)是再灌注損傷的決定性因素。再灌注期間，線粒體通透性決定了細胞存亡：如果通透性較小，細胞可能恢復；通透性中等，細胞發生凋亡；通透性大，細胞則因為能量供應不足而壞死。在心肌缺血期間mPTP是關閉的，僅在再灌注的前幾分鐘開啟，以適應線粒體鈣超載、氧化應激、pH的恢復以及ATP耗竭。這個通道的開放破壞了線粒體膜電位，阻斷了氧化磷酸化，導致了ATP的耗竭，細胞死亡。
此外，細胞內諸如H+、Ca2+量的改變破壞了線粒體膜電位，導致了活性氧自由基的產生。活性氧會直接損傷DNA、蛋白質、脂類，這種非特異性的損傷經過細胞因子介導，生成腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α過表達的TNF-α與心肌細胞上的腫瘤壞死因子受體結合，引起心臟收縮功能障礙、心肌肥大、纖維化和細胞死亡。胞內過量的Ca2+與焦磷酸形成復合物，同時產生尿酸，磷酸鈣和尿酸被稱為“危險信號”，都是強炎癥刺激物。炎癥刺激物包括現有炎性分子的增多以及白細胞介素-1β(interleukin1β，IL-1β)的分泌等。這些炎性物質刺激Toll樣受體(TLRs)進而通過激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)促進炎性細胞因子和趨化因子產生。在再灌注的起初6 h，梗死區域內中性粒細胞趨化因子釋放，并在未來24h遷移到心肌組織。此過程促進中性粒細胞黏附，引起血管堵塞，并釋放降解酶和更多的ROS。正如上文所述，這些代謝變化又直接影響組織的炎癥和完整性，甚至細胞的存活。
4缺血再灌注損傷與信號通路
4．1 Toll樣受體4信號通路
Toll樣受體4(Toil-likereceptor 4，TLR-4)是1997年Rock等初次發現的一種類果蠅源的Toll樣受體，在人體內分布較為廣泛。TLR-4介導的信號通路包括髓樣細胞分化因子88(myeloiddifferentiation factor 88，MyD88)依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑。MyD88依賴性途徑是通過其與TLR-4相互作用，經TIR區域向細胞內傳遞信號，活化NF-κB進入細胞核，誘導一系列特定基因的表達，引起多種炎性細胞因子的釋放，造成細胞損傷。
Wang等采用BALB/c小鼠和TLR-4先天性缺損小鼠(C3H/HeJ)研究肝臟IRI。實驗發現，C3H/HeJ組小鼠肝功能損傷程度、血清TNF-α水平顯著低于對照組，提示TLR-4受體激活，可增加TNF-α參與肝臟IRI損傷。Zhai等進一步研究發現，TLR-4敲除對小鼠肝臟IRI有保護作用，而TLR-2敲除無此作用。Oyama等在小鼠心肌IR模型中發現，TLR-4缺陷型小鼠(C57/BL10ScCr)心肌中多形核白細胞(polymorphonuclear，PMN)浸潤顯著減少，炎癥反應減輕，心肌梗死面積較小。Chong等采用C3H/HeJ(TLR-4基因缺失)小鼠復制了心肌IRI實驗，驗證了TLR-4介導心肌IRI損傷的結論。Wu等在研究腎臟IRI時發現，缺血后腎小管上皮細胞存在TLR-4表達和PMN浸潤，而TLR-4缺陷型小鼠在IR后腎功能和腎實質損傷明顯減輕。同時，在MyD88缺陷型小鼠身上觀察到和TLR-4缺陷型小鼠一樣的保護作用，說明TLR-4通過MyD88依賴性信號通路介導IRI。后來，Hua等研究發現，TLR-4缺失型小鼠保護心肌IRI的作用可被磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(phoshatidylinositol-3-kinase-serine/threonine kinase，PI3K/Akt)抑制劑消除，提示TLR-4和PI3K/Akt通路存在交叉，TLR-4-/-小鼠抗心肌IRI是通過PI3K/Akt信號轉導通路實現的。
4．2缺氧誘導因子信號通路
細胞感知氧水平改變，供氧不足時改變細胞生理狀態，通過缺氧誘導因子(hypoxia-inducibletranscription factor，HIF)氧敏感性轉錄通路，結合缺氧調控元件(HRE)，調控多種基因表達，提高細胞對缺氧的適應性。同時，HIF在IRI中也表現為一種有益因子。Nataraian等通過siRNA干擾小鼠微血管內皮細胞PHDs表達來增加HIF的表達，發現iNOS表達也隨之增加，IR后，梗死面積顯著減少。然而，iNOS基因敲除的小鼠無抗IRI的作用。Xi等在體外模型中應用氯化鈷激動HIF，發現能減少梗死面積，而在iNOS敲除的小鼠器官中則沒有觀察到保護作用。這些研究表明，在IRI中，HIF可以上調iNOS消除IR產生的ROS發揮保護作用。
Pachori等用RNA技術誘導大鼠血紅素加氧酶1(heme oxygenase，HO-1)過表達，觀察到HO-1過表達的大鼠心臟、肝臟等器官在發生IR時損傷減輕，這是由于HO-1及其催化產生的血膽紅素、CO均具有抗氧化應激損傷的作用。HO-1催化氧化需消耗大量氧分子，競爭了氧自由基的氧來源，減少氧自由基的產生。膽紅素能清除活性氧，在多種疾病中發揮抗氧化作用，而CO在一定范圍內可減少ROS的生成。再灌注時HIF上調，誘導HO-1表達增加，通過上述途徑發揮抗氧化作用，減輕器官的再灌注損傷，這可能是HIF抗IRI的又一途徑。
4．3促分裂素原活化蛋白激酶途徑
促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinases，MAPKs)途徑是介導細胞反應的重要信號系統，參與了細胞生長、發育、分裂、死亡以及細胞間的功能同步等多種生理反應的過程。MAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，由多種同工酶組成，主要包括細胞外調節蛋白激酶(extracellularregulated protein kinases，ERK)、c-Jun氨基酸末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38MAPK。
4．3．1 ERK信號通路
ERK被認為是經典的MAPK信號通路途徑。研究發現，ERK在正常細胞中低表達，而受到IR的刺激后，pERK顯著上調。對于IR刺激下ERK通路的激活，是發揮保護作用還是介導凋亡，學術界尚無定論。
部分學者認為ERK通路激活在IRI中發揮保護作用。Tao等研究發現，1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，SIP)通過激活ERK促進成年小鼠心肌細胞在IR模型中的存活。Yue等和Das等報道激活ERK通路可減少IR誘發的細胞凋亡，宏觀上縮小心肌梗死的面積。ERK通路可能通過如下幾個方面發揮保護作用：
①ERK促進B細胞淋巴瘤基因2(B-celllymphoma gene 2，Bcl-2)表達，拮抗凋亡蛋白Bax表達，減少caspases-3活化；
②Bcl-2與c-myc共同阻止p53入核及其誘導細胞凋亡作用；
③ERK激活核糖體S6蛋白激酶(RSK)可使環腺苷酸應答元件結合蛋白(cAMP)磷酸化，協同抑制細胞凋亡，促進細胞存活；
④ERK激活可提高ATP水平，恢復供能；
⑤可拮抗JNK，p38信號通路的促凋亡作用。
另外一部分學者則持相反觀點。Stanciu等、Tsoporis等和Tong等在各自的研究中發現，激活ERK通路會導致培養的細胞的IRI加重。更多的研究分析ERK可能通過以下途徑介導損傷：
①ERK是p53的上游信號分子，pERK可激活p53磷酸化，介導細胞凋亡；
②ERK激活后通過ERK1/2/Elk/Egr-1通路上調Egr-1蛋白，介導IR損傷；
③ERK激活miR-1和miR-206抑制Hsp60表達，削弱Hsp60保護作用，加重器官IRI；
④ERK激活可導致活性氧(ROS)產生增加，引起IRI。
ERKs作為MAPKs中經典通路，參與了細胞生理、病理過程。不同的實驗發現ERK在IR中扮演了截然相反的角色，這可能與IRI進程有關。IRI早期，ERK的激活可啟動內源性的保護機制，而在IRI中晚期則以介導細胞損傷為主。
4．3．2 JNK通路
JNK位于細胞質中，當IR刺激激活JNK發生磷酸化時，pJNK轉入細胞核中參與細胞增殖、代謝、凋亡等調控。Ferrandi等在大鼠心肌IR模型中應用AS601245(JNK選擇性抑制劑)可以減少細胞凋亡和梗死面積。Okuno等研究發現，腦缺血區的pJNK水平增高，應用JNK抑制劑SP600125可以阻止Bax從胞質轉入胞核，抑制神經元的凋亡。Carboni等應用抑制劑AS601245處理小鼠神經細胞可有效減輕IRI。大量實驗發現，IR發生時，JNK活性顯著升高。其抑制劑可降低IR引起的細胞凋亡，提示JNK參與了IRI的進程。
JNK在IRI中介導細胞凋亡主要有兩個機制：
①轉錄因子途徑：JNK激活后調控下游因子轉錄，上調凋亡蛋白表達，介導凋亡途徑引起細胞凋亡，如：JNK活化后進入細胞核，啟動轉錄因子和ATF-2、AP-1、Elk-1等，誘發FasL、TNF-2、BH3-only蛋白表達上調，激活凋亡程序；
②非轉錄因子途徑：部分活化的JNK不進入細胞核，不參與轉錄、調控，而是在細胞質中直接作用于Bcl-2，引起線粒體通透性的改變，誘發細胞凋亡。
4．3．3 p38 MAPK信號通路
p38 MAPK是MAPKs中的又一重要通路。活化的p38在細胞成活、分化、發育、炎癥以及應激反應等生理、病理進程中發揮重要作用。IR發生時，釋放的氧自由基和細胞因子激活p38 MAPK，將胞外刺激傳遞到胞內，引起蛋白表達改變，誘發細胞凋亡。研究發現，在再灌注前使用p38 MAPK特異性阻滯劑SB203580、FR167653等可以有效抑制p38MAPK的激活，減少再灌注器官的損傷。p38 MAPK通過以下幾個途徑介導細胞凋亡：
①上調c-myc表達，c-myc是細胞凋亡的主要誘因；
②促進p53磷酸化；
③參與Fas介導的凋亡；
④激活c-Jun和c-fos；
⑤誘導Bax轉位；
⑥激活NF-κB，提高TNF-α等炎性因子表達，誘發細胞炎性損傷。
細胞的炎性損傷和凋亡導致再灌注器官的功能障礙和衰竭。
4．4磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路
Akt是PI3K/Akt通路的核心，也是PI3K下游的直接作用靶點。許多細胞因子、生長因子、理化刺激均可以活化PI3K，從而磷酸化Akt，激活下游級聯反應和靶蛋白之間的相互作用。
大量研究表明，在IR發生時，激活PI3K/Akt信號通路可以顯著抑制心肌細胞凋亡，縮小梗死面積。Li等發現，胰島素與受體結合，可激活其受體的酪氨酸激酶，進一步激活PI3K/Akt通路，上調下游靶蛋白p70S6K和eNOS，產生保護心肌的作用。Raphael等應用異氟烷預處理兔體，發現其心臟在IRI中梗死面積和凋亡細胞減少，Westernblot顯示pAkt、pBad和Bcl-2上調，而Bax下調，PI3K抑制劑可拮抗該保護作用，提示PI3K/Akt活化后可減少Bad介導的細胞凋亡，參與了異氟烷對IRI的保護作用。馬亞飛等研究發現，葛根素預處理亦可對抗心肌IRI，這種保護作用可以被Akt選擇性抑制劑LY294002阻斷，推測葛根素的保護作用可能也與PI3K/Akt信號通路的激活有關。王巖采用分別給予PI3K、Akt、eNOS抑制劑的方法干預普伐他汀對心肌IRI的保護作用，結果顯示PI3K、Akt、eNOS均可特異性拮抗普伐他汀對兔心肌IRI的保護作用，顯示普伐他汀通過PI3K/Akt/eNOS信號通路發揮作用。
實驗觀察到不同種類藥物發揮IRI保護作用時均激活了PI3K/Akt信號通路，而特異性抑制劑拮抗其保護作用，說明PI3K/Akt通路的激活對心臟起保護作用。更多研究表明，活化Akt能作用于下游eNOS、Bcl-2、GSK-3β、caspase-9、p70S6K等多個靶點，并減少mPTP的開放，穩定線粒體膜，減少促凋亡因子活化，發揮抗凋亡、保護再灌注器官的作用。
5總結與展望
綜上所述，HIF作為特異性氧敏感性轉導通路在缺血及再灌注2個損傷環節均發揮重要調節作用。MAPKs在IR時激活，ROS與MAPK通路存在交互作用，ROS能誘導MAPK的激活，同時這些激酶亦可反作用調節ROS水平。p38被證實可以調節線粒體內ROS水平，通過Raf/MEK/ERK通路對抗線粒體內過多的ROS和Ca2+，減少細胞凋亡。然而ERK是否起到細胞保護作用仍然未有定論。另一方面，先天免疫和炎癥在IRI中已有深入研究，促炎因子和免疫調節因子在IR時表達增加。Toll樣受體是這些免疫和炎癥誘導物的結合受體，它在炎癥誘導的IRI中起核心作用。細胞損傷時釋放的高遷移率蛋白(HMGB1)是一種TLRs配體。ROS可通過上調HMGB1，增加其與TLRs結合來激活NF-κB，經NF-κB信號介導在IRI時調節炎癥因子的產生。在諸如腦、肺、肝、腎、腸等器官中也觀察到了相似的作用。此外，PI3K/Akt的激活可以對抗缺氧復氧誘導的心肌細胞凋亡。心肌缺失TLR-4小鼠的NF-κB結合激活減少以及Akt磷酸化水平增加，不易發生IRI，而使用小分子抑制PI3K可以完全消除TLR-4缺失小鼠的IRI心肌保護作用，提示TLR-4和PI3K/Akt通路存在交叉。
目前，在臨床上防治IRI并無特效藥物，隨著IRI與細胞信號轉導研究的不斷深入，對IRI發病機制的了解也越發透徹，這為防治IRI新藥的研發提供了更多嶄新的思路。