《第三軍醫大學學報》1995年05期
陸松敏劉建倉郭素清王成英劉光海陳惠孫
【摘要】：
采用家兔失血性休克模型，測定紅細胞膜脂的流動性，膜脂區微粘度及相變溫度。
結果說明失血性休克后紅細胞膜的熒光偏振度（P）升高，從0．260±0．020升至0．289±0．015（P＜0．01），膜流動性降低。膜脂雙層分子排列有序性增加。相變溫度傷前為17．5℃，低血壓３ｈ后相變溫度為24．5℃，分子活化能升高。說明失血性休克后紅細胞膜從相對比較流動變為相對固化，細胞膜更趨于凝膠相。
【作者單位】：第三軍醫大學野戰外科研究所第二研究室
【關鍵詞】：休克失血性紅細胞膜膜流動性
【基金】：全軍“八五”攻關項目
細胞膜的流動性是一個細胞水平較為靈敏的檢測指標，它反映細胞膜脂區分子的運動狀態和分子排列的有序性，它是維持細胞正常生命活動所必需的。為了更好地從細胞和分子水平研究休克機理，我們研究了失血性休克條件下紅細胞膜的流動性、微粘度、膜脂區相變溫度、脂雙層分子排列有序性系數及分子運動所需活化能。
１材料和方法
采用體重2．5kg左右健康雄性家兔20只，分為對照組和失血性休克組，每組10只。采用改良Wigger’s模型，快速放血至5．3kPa，維持2h，然后繼續觀察至5h，分別于失血性休克前、低血壓后1、2、3、5h抽取靜脈血3ml，測定紅細胞膜脂流動性，微粘度(η)和脂分子排列有序性系數(r)。
2紅細胞膜的制備
全血3ml，300×g離心10min，去上清及界面白色膜、留壓積紅細胞。再用pH7．8～8．00 0．01 mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水溶液(PBS)洗3次(0～4℃)，每次離心5min，轉速為300～g，得3ml PBS紅細胞懸液，以體積1：80的比例，用5mmol/L Tris-HCl(pH；7．5～7．6)緩沖液實行一次性溶血，于4℃靜置1～2h取出，以1000×g 4℃離心15min，反復洗滌離心4次得白色紅細胞膜，用Lowry法定蛋白。
取膜懸液(300μg/ml)3ml，加入2×10-6濃度的DPH(1．6-Dipheny-1、3、5 Hexatrine、Sigma、ChemicalCo)30μl，于25℃溫育30min，在MPF-4型熒光分光光度計上測定熒光偏振度(P)，計算微粘度(η)和分子排列有序性系數(r)。測定時激發波長為365nm，發射波長為440nm。
式中Ivv為起偏器光軸為垂直方向，檢偏器光軸為垂直方向時熒光強度，IvH為起偏器光軸為垂直方向，檢偏器光軸為水平方向時熒光強度。G為校正因子，G=IHV-HV/IHH，IHV為起偏器光的水平向、檢偏器垂直向時熒光強度。IHH：二者均為水平向。
膜相變溫度的測定采用熒光偏振法：將已用DPH標記好的紅細胞膜懸液，置0℃冰浴后，從0℃至45℃每升高5℃測定一次熒光偏振度，再以log(P)對1/T作圖，其曲線的拐點即紅細胞膜的相變溫度。
3實驗結果
3．1失血性休克對紅細胞膜流動性、膜脂區微粘度（η）及脂雙層分子排列有序性系數(r)的影響
在失血性休克低血壓2h后紅細胞膜熒光偏振度升高(P<0．01)，膜流動性降低，微粘度顯著升高(P<0．01)，脂雙層分子排列有序性增加(P<0．01)。隨著休克時間的延長脂分子排列更有序，分子運動減少。三者變化關系基本平行(表1)。
3．2失血性休克時紅細胞膜相變溫度的變化
傷前、失血性休克后2、3、5h紅細胞膜在不同溫度下的熒光偏振度(P)變化見表2。以logp對1/T作圖，曲線的拐點即為相變溫度．結果為：傷前紅細胞膜相變溫度為17．5℃，失血性休克后2h為21℃，3h為24．5℃，5h為25．0℃。說明失血性休克后紅細胞膜分子結構和化學組成發生了變化。
4討論
細胞膜的流動性指細胞膜、內質網膜、線粒體膜系統具有類似于液體那樣容易流動的一種物理性質。1972年Singer和Nicolgon提出細胞膜的結構的液態鑲嵌模型，即膜中脂和蛋白質分子處于不停息的運動中，從而使膜處于一種動態結構中。這些運動和溫度有關。所以在不同溫度下膜擴散速度和旋轉速度及烴鏈的活動均不同，使得膜在高溫下更接近液態，而在低溫下更接近固態，兩種狀態的轉折點稱之為相變溫度。
細胞膜的流動性和通透性是細胞的基本和重要的生物物理性質，膜流動性不僅能影響膜通透，且影響膜上的酶的活性、受體功能及能量傳遞，也影響細胞膜的保護功能。膜流動性反映著膜磷脂的分子運動狀態，包括側向擴散，繞分子長軸的旋轉、異構運動和翻轉運動。流動性是脂雙層中磷脂分子各種運動狀態的總和的平均表現。流動性越大，則意味著磷脂分子的活動度增大。
膜流動性可用核磁共振，電子自旋共振，熒光偏振等方法來測定。本研究采用穩態熒光偏振法，因為DPH能嵌于脂雙層中和磷脂分子平行排列，烴鏈不活動，則DPH排列整齊，熒光偏振度大，膜流動性小；如果分子運動大，脂分子呈不同程度的傾斜，則熒光偏振度小，流動性就越大。
影響膜流動性的因素很多，從構成膜的磷脂和蛋白質來看；磷脂分子中脂肪酸鏈的不飽和程度，脂與脂、脂和蛋白質之間的相互作用均十分重要。膜磷脂的化學組成、不飽和程度、脂肪鏈的長短均起作用。Orly和Sehram報告減少不飽和程度，增加鏈長均可減少膜流動性。磷脂中不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸比值越高，則膜流動性就越大。此外膜脂的構型、酸堿、氧張力、乙醇胺等對流動性均有影響。
磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺均是天然哺乳動物生物膜的主要成份。Hirata和Axelrod報告磷脂酰乙醇胺甲基化形成磷脂酰膽堿，從而增加膜流動性。休克時膜成份分析指出：肝細胞膜中磷脂酰膽堿較多地被水解，而磷脂酰乙醇胺水解較少。磷脂酰膽堿含量下降，所以流動性下降，相變溫度升高。
磷脂酶A2(PLA2)在許多生化過程中和細胞膜改變中是一個關鍵性的酶，是休克的重要啟動因子。外源性PLA2和嵌于細胞膜深層的PLA2對細胞膜流動性起重要調控作用，調節著膜結構，改變膜流動性。外源性PLA2能消化細胞膜，水解不飽和脂肪酸的C-2位，從而增加飽脂肪酸/不飽和脂肪酸之比，故此改變流動性，使細胞膜從相對地流動變得權對固體化。Liu-Maw-Shung等指出PLA2激活是內毒素休克的重要機制之一。我們的實驗已證明失血性休克、內毒素休克時，血漿、肝、心、腸中PLA2顯著升高。
本實驗結果說明；失血性休克早期和晚期細胞膜流動性降低，膜相變溫度升高與分子排列有序性增加和分子活化能升高有關。細胞膜從相對較流動變得更趨于凝膠相。造成膜流動性變化的原因可能與磷脂酶激活、膜脂成份改變、不飽和脂肪酸水解、不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸之比改變有關。Stark等指出：磷脂成份變化主要原因是花生四烯酸及大量脂介質的釋放，如溶血性磷脂酰膽鹼、血小板激活因子、烷酸類、白三烯等大量不飽和脂肪酸釋放于脂肪池從而影響膜的流動性。
在休克時膜的蛋白和脂肪酸上的NH2可與脂質過氧化物丙二醛交聯，使流動性下降。同時不飽和脂肪酸氧化后，不飽和鍵大量減少，膜脂相凝固點相對升高，流動性降低，相變溫度升高。Petkova等證明膜流動性與膜上內源性PLA2呈負相關，即膜的硬化可激活內源性PLA2。同時又指出：改變脂質體的脂成份就改變了膜的流動性。影響細胞膜流動性的因素很多，各種細胞毒素因子的調控作用、酰基轉移與基因表達的關系等均待進一步深入研究。
實驗證明決定低血容量休克復蘇后的存活率和存活時間的因素之一是休克狀態持續的時間。嚴重創傷出血后前1個小時之后活存率明顯下降。前1小時被稱為“黃金小時”。朝鮮和越南戰爭的經驗使軍醫相信這段時間是關鍵時刻，而本實驗報告了失血性休克后紅細胞膜生物物理參數的變化，說明休克后細胞膜流動性下降、細胞膜從相對比較流動變得比較固化，紅細胞膜更趨于凝膠相。分子排列有序性增加，電子活化能升高，電子在能級間傳遞和躍遷困難。同時流動性改變也必然影響到膜上酶、受體等的功能。這與休克的發生發展有關。本實驗中細胞膜的流動性和膜脂相變溫度在失血性休克后1h無顯著改變，2h后產生了顯著改變，提示了以上臨床改變的分子生物學基礎。