黃益民，趙輝，虞欣，鐘偉，郭金良，孫素琴，李勇，公衍道，丁小蘭
北京心肺血管疾病研究所血液流變學研究室，北京100029；
清華大學分析中心，北京100084；
清華大學生物科學與技術系，北京100084
摘要：
為探明自由基對紅細胞膜脂質及蛋白分子損傷機理，本文通過電子自旋共振波譜儀（ESR）、激光拉曼波譜儀、圓二色波譜儀（CD）、顯微付立葉變換紅外波譜儀（MFT-IR）和表面電子能譜分析系統（ESCA）分別對體外自由基作用30分鐘后，及作用后3小時紅細胞膜整體結構、膜蛋白分子及脂質分子進行了分析。
結果發現，自由基作用后：
①紅細胞膜中β-胡蘿卜素構象由伸展變為卷曲，提示膜整體結構改變；
②膜蛋白分子二級結構變化，表現為α螺旋減少和β折疊增加；
③膜蛋白分子二硫鍵與巰基的比例增加（S-S/SH）、亞氨基（NH）和羰基含量改變，同時蛋白分子的氫鍵也被破壞（如NH、COH等基團的減少和VC、CO的增加）；
④膜脂分子磷氧雙鍵（P=O）成分、羰基成分（C=O）、碳-碳雙鍵（C=C）成分降低；說明自由基導致紅細胞膜蛋白及脂質分子化學結構改變是造成膜分子構象及膜整體結構改變的根本原因。
3小時后無論是膜蛋白二級結構、二硫鍵與巰基比或膜脂分子P=O、C=O、C=C不僅沒有恢復，反而有加重趨勢。這說明了自由基損傷的部分不可逆性。
紅細胞膜的流動性是紅細胞順利通過毛細血管完成與組織氧交換的重要保證。紅細胞膜是由磷脂雙層(外層主要為磷脂酰膽堿和神經鞘磷脂與膽固醇形成互補作用，內層主要為磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲胺酸與膽固醇反互補)、鑲嵌蛋白及支撐于膜內側的膜骨架蛋白構成。膜脂分子在脂雙層結構中是不對稱性分布的，同時它們還不停地進行著軸旋轉、烴鏈的擺動及同層水平擴散等三種主要運動；而一些膜蛋白如一些受體、一些酶和一些通道等同樣也不停的旋轉和在脂雙層中擴散；這種分子運動不僅是紅細胞膜流動性的基礎，同時也是這些分子發揮功能的必要條件。成熟紅細胞外層的多不飽和酰磷脂烴鏈中的碳-碳雙鍵的鍵角度使外層磷脂分子排列無序、疏松，分子間作用力較弱，流動性較大，而內層分子主要是飽和酰磷脂，有序性強，流動性較小。膜蛋白(骨架蛋白、受體、酶、抗原等)的二級結構中的α螺旋伸入到膜脂雙層中，其螺旋外側的疏水基團與脂雙層疏水區的烴鏈形成疏水鍵，而二級結構中的β折疊多是鋪于膜表面與磷脂形成疏水和靜力作用，穩定及調節膜脂雙層的不對稱分布及流動性。膜脂分子及蛋白分子的流動性受著分子結構及相互作用關系的影響并終會影響整體膜的流動性。膜骨架是由多種蛋白相互連結而形成的網狀結構，其蛋白成分不具有獨立的及隨機的運動；除支撐作用外，通過其部分蛋白嵌入膜脂雙層而達到穩定及調節膜流動性的作用。膜骨架是紅細胞膜彈性的主要決定因素。同樣某些因素引起其分子結構改變終將會影響整個細胞的彈性。
自由基是含有不配對電子的高活性物質，它通過電子傳遞而與其它分子發生氧化-還原反應。自由基是自然存在的并是許多生理過程所需的，但當其產生過量或出現在不適當的細胞部位將通過過氧化反應而導致分子的結構及功能的破壞后面造成細胞、組織的病理改變。前期的研究已證明自由基特別是以氧為中心的自由基通過脂質過氧化而引起膜脂分子結構的改變，表現為烴鏈碳-碳雙鍵的減少和游離脂肪酸的釋放，此外自由基對蛋白分子的攻擊可造成蛋白分子結構及功能的改變。這些分子結構的改變將影響其流動性。A．M，Phelar報導了在腦缺血/再灌注期間腦毛細血管內皮細胞膜脂質區流動性明顯降低，認為與此期間產生的自由基損傷有關。紅細胞由于有一個高氧含量并與氧反復混合，膜含有大量的高活性碳-碳雙鍵的多不飽和脂肪酸，血紅蛋白可提供催化產生損傷性自由基的鐵離子而對過氧化損傷尤其敏感。我們前期的研究發現，人紅細胞于體外與Fenton自由基體系作用30分鐘后，不僅引起細胞膜剪切彈性模量(the shear elasticmodulus of membrane)明顯增加，同時還引起膜脂質及蛋白分子流動性明顯下降，3小時后，只有脂質分子的流動性回復正常，而蛋白分子流動性及膜的彈性模量只是部分回復。為探討自由基引起的紅細胞膜脂質及蛋白分子結構變化特征與這些分子流動性改變間的關系，本文利用電子自旋共振、激光拉曼、顯微付立葉變換紅外、圓二色及電子能譜化學分析系統等技術對體外自由基作用前后紅細胞膜脂質及蛋白分子構象及化學結構的改變進行了分析研究。
1材料及方法
1．1自由基體系：
按照下列方法配制高、低濃度的Haber Weiss(Fenton)羥自由基體系。高濃度按1：1：1的容積比將3％的H2O2、450μmol/L的FeSO4和2．7％的NaCl混合制成等滲、pH7．0的羥自由基體系；低濃度按0．5：1：1．5的容積比將3％的H2O2、450μmol/L的FeSO4和1．8％的NaCl混合制成等滲中H7．0的羥自由基體系。分別在以上體系配制后的即刻、十分鐘、三十分鐘和一小時用自旋捕捉劑DMPO(5，5-DIMETHYL-1-PYROLINEN-OXIDE)捕捉自由基，并于室溫條件下用電子自旋共振波譜儀(ESR Bruker ER-200D)在微波功率SP=10mW(13db)、調制幅度MA=5G、放大增益GN=5×104、中心磁場CF=3470G、掃場寬度SW=200G的條件下測自由基水平，證明配制后即刻已產生大量自由基且在一小時內被捕捉的自由基信號強度無明顯改變。
1．2自由基對人紅細胞的損傷及恢復：
十名健康成人紅細胞(男女各五名)經等滲磷酸緩沖液(PBS)清洗兩遍后分別與以上兩自由基體系在室溫條件下作用30分鐘。作用后的紅細胞經PBS清洗兩遍后部分再于室溫條件下于PBS中靜置3小時。
1．3紅細胞血影的制備：
自由基作用前、作用30分鐘和靜置3小時的紅細胞用低滲Tris緩沖液(10mmol/LpH7．4)破膜40分鐘，高速離心(25，000轉/分，4℃)40分鐘，去上清，用低滲Tris在上述離心條件下反復清洗沉淀物數遍，直至變為乳白色；再用0．9％NaCl液于50，000轉/分、4℃、60分鐘的條件下清洗沉淀物，去上清后獲得紅細胞血影。
1．4紅細胞膜結構及分子構象的測定：
1．4．1用激光拉曼波譜分析儀(LRSSPEX-1403)在室溫、功率500mW、波數范圍950～1750cm-1、激發波長518．5nm的條件下，測定紅細胞血影中β-胡蘿卜素特征譜波數1528 cm-1/1446 cm-1的改變，觀察膜中β-胡蘿卜素的構象變化從而反映整體細胞膜結構的改變。
1．4．2將待測紅細胞100μl再懸浮于PBS中，加入10-3mol/L的3-MCP3-(3-MALEIMIDOPROPYL-CARBAMOYL)-PROXYL 8μl充分混勻，室溫靜置2小時，標記膜蛋白巰基(-SH)。2小時后離心去上清，于室溫條件下用ESR測定標記物的譜強及(測定條件SW=50G，SP=13db，MA=5G，CF=3470G，GN=5×104分子相對旋轉時間，反映膜蛋白分子的宏觀構象改變及分子運動性(圖1)。
1．4．3將待測紅細胞血影均勻涂抹于CaF2載樣片上，在室溫條件下用顯微付立葉變換紅外光譜分析儀(MFT-IRPE2000)測定和記錄血影蛋白酰胺Ⅰ譜帶1600～1700cm（-1）的紅外光譜，光譜采集100次，對去卷積譜以高斯曲線擬合，蛋白二級結構中的α螺旋、β折疊及卷曲等各組分的含量根據組分譜帶的相對峰面積計算獲得。同時將以上待測血影10μl懸浮于1ml的PBS中并加入樣品池中，在室溫、掃描速度50nm/min、波長擴展10nm/cm、采集8次、采樣間隔10ms、間隔時間1min、波長范圍250～190nm的條件下用圓二色光譜分析儀(CD J-500C)測定并記錄血影圓二色光譜通過曲線擬合分析血影蛋白二級結構各成分的改變。
1．5紅細胞膜分子化學結構的測定：
1．5．1用(MFT-IRPE2000)測定和記錄血影900～3700 cm-1范圍的譜帶，方法同1．4．3；計算3012cm-1、1234cm-1、1067cm-1峰面積比，分析膜脂分子疏水區碳-碳雙鍵(-C=C-)、親水區磷-氧雙鍵(-P=O)、膜界面區羰基(C=O)等基團含量的變化。
1．5．2將待測紅細胞血影均勻涂抹于蓋玻片上，真空干燥后用電子能譜化學分析系統：(ESCA PE-PHl5300)在角分辨率45°、真空度10-10托、分辨率0．8eV、靈敏度8×104CPS、過能35．75eV、功率250W的條件下測定并記錄膜中含硫基團(S-S、SOx、SH)、含碳基團(C=O、C-OH)、含氮基團(NH、NOx、NQ)的電子光譜，通過曲線擬合分析以上各化學基團的含量及比例變化和膜中分子化學結構的改變。
1．6數據分析：
用T-檢驗對自由基作用后的各實驗參數與實驗前有關參數進行醫學統計學比較，設定P＜0．05時具有顯著性差異，各參數以均值±標準差(X±SD)表示。根據公式{(改變指標-對照指標)/對照指標}×100％=變化率(±％)計算改變幅度，+代表增加，-代表降低。
2結果
激光拉曼分析結果顯示，高濃度自由基作用后紅細胞血影的1528cm-1/1446cm-1譜峰比與作用前相比盡管沒有明顯統計學差異，但平均降低幅度遠大于低濃度自由基體系(約-40％比-21．6％)。由于1528cm-1/1446cm-1譜峰比的升高或降低反映β-胡蘿卜素伸展構象或卷曲構象的比例變化，此處1528cm-1/1446cm-1譜峰比的降低則說明了高濃度自由基作用30分鐘后，引起紅細胞膜中β-胡蘿卜素卷曲構象成分增加，提示膜分子間隙增大，膜整體結構改變(表1)。
無論高濃度或低濃度自由基體系作用30分鐘后，ESR測定紅細胞膜蛋白分子標記物的相對旋轉時間均大幅度延長(表2)，但低濃度自由基作用后的變化較輕。由于膜蛋白分子運動速度較慢，因此此處被延長的相對旋轉時間除說明膜蛋白分子運動性的降低外，還提示了標記物周圍環境對其分子運動性的限制增加即蛋白構象(結構)改變。有意義的是在分子旋轉時間延長的同時ESR測定到的標記物信號強度則成倍增加(表2)：由于標記物特異性結合于巰基(SH)，因此不難理解在自由基作用后，紅細胞膜暴露的SH可結合位點增加，這是膜蛋白構象改變的重要證據。以上改變在3小時后只獲得了小部分回復，但仍明顯高于對照值，說明自由基引起膜蛋白結構改變幾乎是不可逆的。
CD測定的結果顯示，兩個濃度的自由基的作用都使紅細胞血影膜蛋白的二級結構中α螺旋成分比例減少(減幅分別為-15．8％和-13．7％)，而β折疊及卷曲成分比例相應增加；3小時后上述改變少回復(表3)；說明自由基導致了紅細胞膜蛋白結構發生重構，這一結果進一步證實前面由ESR測定的自由基引起膜蛋白結構(構象)改變的發現。MPT-IR的測定結果與CD測定結果相吻合(表3)。
表4所示為ESCA測定紅細胞膜血影的含硫成分含氮成分、含碳成分的改變情況：高濃度的自由基作用后膜上巰基在總含硫基團中的比例有所減少(減幅約-7．7％)，而S-S和SOx等基團的比例增加(增幅分別為約+3．3％和+6％)，3小時后SH進一步減少、S-S進一步增加、SOx則基本回復到對照水平。在含氮基團的變化中，亞氨基(NH)在自由基作用后有所降低(降幅為-6％)，氮=氧基(NOx)和NCx基團相應增加，(平均增幅為+7．7％和+2％)；3小時后NH基團比例基本回復，NCx只部分回復(仍高出對照+1．5％)，而NOx基團則低于對照。含碳基團中，在自由基作用后，COH基團比例減少，C=O基團比例增加；3小時后COH繼續降低而CO基本回復。上述結果提示：自由基造成了紅細胞膜蛋白分子結構的改變，其中巰基被氧化而形成雙硫鍵和氧化硫基團，亞氨基被氧化成氧-氮基或氮-碳基結構，碳羥基被氧化又羰基。由于SH、S-S主要存在于膜蛋白中，是蛋白重要官能團及維持蛋白結構(構象)的重要化學鍵，本文中的變化則說明了自由基作用后膜蛋白發生結構上的重構。NH基團和COH基團又是構成維持蛋白正常二級結構的氫鍵中的重要官能團，他們的減少同樣提示了自由基對膜蛋白氫鍵的破壞。
除ESR測定的膜脂質區分子相對旋轉時間在自由基作用后延長、并于3小時后完全回復外，MFT-IR測定結果顯示，兩種濃度的自由基作用后紅細胞膜脂的磷氧雙鍵(P=O)、羰基(C=O)和碳-碳雙鍵基團(C=C)都有所減少。由于含磷基團多位于膜磷脂的親水端即膜表面側，羰基位于磷脂分子的膜親-疏水界面區、碳-碳雙鍵則是膜磷脂分子疏水端—多不飽和脂肪烴鏈的主要成分，位于細胞膜的中間部分，因此上述改變提示本研究中自由基對膜表面和膜內部同時造成了損傷，推測自由基使膜磷脂的不飽和鍵部分轉變為飽和鍵及羰基，這些分子結構的改變是膜脂分子旋轉時間延長的主要原因。3小時后高濃度自由基作用的紅細胞胺P=O、C=O繼續減少和C=C無回復，而低濃度自由基作用的紅細胞膜的P=O、C=C成分則有一定程度的回復(表5)，但在本研究所測的變化中總的表現出自由基濃度與各變化間有一定的量效關系，即隨自由基濃度增加改變加重。
3討論
本研究中對紅細胞血影中β-胡蘿卜素的構象測定表明了自由基作用后，造成了膜整體結構的改變。紅外測定結果則進一步證實此時C=C減少。我們認為這是由于自由基使部分膜磷脂疏水區烴鏈的不飽和鍵形成飽和鍵以及脂質自由基之間的加成反應而使脂環內過氧化物形成所致，更重要的是我們同時發現了自由基作用后P=O和C=O基團的減少，說明自由基不僅攻擊膜內部的不飽和烴鏈，同時還損傷膜磷脂分子親水端頭部的磷酸基或磷酸膽堿基及脂分子界面區的甘油骨架，這將導致膜脂分子極性的改變，提示脂質過氧化同時發生于膜表面及膜內部。以上變化終將引起膜脂分子構象、排列更加有序，相互作用增強及流動性降低等特性，進而影響膜的整體結構及功能。
在自由基作用后膜脂分子改變的同時我們還發現了膜蛋白分子結構的改變是以α螺旋成分減少，β折疊和無規卷曲成分增加為主要特征。這些變化將使插入膜脂雙層中的蛋白α螺旋結構減少，膜蛋白與膜脂分子相互作用及束縛力減弱，蛋白維持膜脂分布不對稱性和限制脂分子運動的作用降低，這將有利于發生過氧化反應的膜脂分子重新排列與分布而造成膜正常結構改變。根據ESR的測定結果，我們認為由于自由基損傷后膜蛋白標記位點增加但同時標記分子的運動又受限，說明膜蛋白分子本身構象的變化是以分子在膜表面部分的楔狀缺損為主。在我們的預實驗中發現體外純蛋白與自由基作用30分鐘后也引起其結構與紅細胞膜蛋白結構改變相似的結果，即出現了蛋白構象的變化。進一步分析發現自由基作用后使純纖維蛋白原的NH、CO等基團減少，而NCx、NOx及COH等基團增加，推測在自由基的作用下肽鍵一側N上的氫轉移到另一側的CO上而形成COH從而使N氧化成NOx或肽鍵雙鍵比例增加，由此蛋白分子中于CO和NH之間的氫鍵被部分破壞，進而造成蛋白分子二級結構(α螺旋、β折疊和無規卷曲)發生重構(式3)。
(式3)自由基引起氫鍵破壞后肽鍵改變的兩種可能形式。
ESCA對紅細胞血影膜的分析結果表明，自由基作用后SH減少、S-S和SOx等基團增加。由于巰基(SH)絕大部分為膜蛋白的特異性基團，易被氧化而失去氫原子，因此前述含硫基團的變化證明自由基造成了膜蛋白巰基氧化后二硫鍵和氧化硫基團的形成，這可直接造成膜蛋白結構(構象)的重構，膜蛋白自身功能及與膜脂分子之間的相互作用被打亂。與纖維蛋白原的改變相同的是，自由基作用后NH減少，NCx和NOx等基團增加；但不同的是此時CO增加而COH降低，這可能有兩種解釋：
①因為H2O2和OH很易穿過細胞膜，因此在它們過膜破壞膜蛋白氫鍵的同時，將NH基團上的部分氫原子抽取，并不發生NH基團上的氫往羰基氧上轉移因而COH降低；
②膜脂不飽和鍵被自由基氧化使CO基增加。除上述二硫鍵形成外，此處氫鍵的破壞是本文膜蛋白二級結構(α螺旋、β折疊和無規卷曲)改變的主要原因之一。因此自由基損害膜蛋白結構的機理是自由基通過氧化巰基而形成二硫鍵，同時造成氫鍵破壞、肽鍵雙鍵成分增加，終會導致膜蛋白結構、構象的改變(發生結構重構)。蛋白一旦發生重構后，很難再回復到正常結構，這可從本文中對3小時后血影蛋白分析的結果獲得證實。由于紅細胞沒有合成蛋白而修復或替換被自由基損傷的膜蛋白的能力，因此自由基造成的本文中膜蛋白的損傷是不可逆的。
有意義的是在本文中：
①自由基損傷程度表現出了與自由基濃度有一定的量效關系；
②自由基引起的膜脂分子部分結構上的改變(如頭部的P=O、C=O和CO等基團的改變)在3小時后的回復程度也與自由基濃度有關，提示自由基引起的紅細胞膜脂質過氧化損傷的可逆性取決于損傷程度。
本文中的結果可明確地闡述我們前期有關自由基對紅細胞膜分子流動性影響的機理：即自由基引起紅細胞膜蛋白分子及脂質分子化學結構及構象的改變，從而造成這些分子間正常排列、相互作用的破壞，終使這些分子的流動性乃至整個紅細胞膜的流變性降低；脂質過氧化損傷的部分回復可能是自由基損傷后3小時膜脂分子流動性回復正常的主要原因，但因膜蛋白損傷的不可逆性，3小時后整個紅細胞膜的流變性、彈性模量(主要由膜骨架所決定)的改變只有部分回復。
4結論
本文利用生物物理的手段對自由基損傷后的紅細胞膜蛋白分子和脂質分子的構象、化學鍵的特征性改變進行了分析，證明：
①自由基可損傷膜的完整性；
②自由基可通過氧化蛋白SH(巰基)形成S-S(二硫鍵)SOx(氧化硫)等基團，引起氫轉移而破壞氫鍵，改變肽鍵結構，使蛋白發生結構重構；
③自由基不僅造成脂疏水烴鏈中不飽和鍵的減少，同時還攻擊其親水頭部及界面區而引起膜磷脂分子極性、構象和有序性的變化；
④以上膜蛋白分子的變化幾乎是不可逆的，而膜脂分子改變的可逆性與自由基損傷程度相關。