《華西醫科大學學報》1999年第1期
馮興民陳槐卿
華西醫科大學生物醫學工程研究室
內容摘要
利用不同濃度的趨化物質N-甲酰甲硫亮氨酰苯丙氨酸(fMLP)處理中性粒細胞，并采用硝基藍四唑(NBX)還原法檢測中性粒細胞激活率，結合流室系統定量地研究了在不同切應力作用下，不同激活狀態的中性粒細胞與人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)粘附的關系。通過顯微鏡觀察、計數及統計分析，結果表明：隨著fMLP濃度的增加，中性粒細胞激活率顯著增加，兩者有著明顯的量效關系。
該實驗還表明：中性粒細胞經fMLP處理后，與對照組一樣，隨著切應力增加，中性粒細胞與內皮細胞粘附率按指數曲線下降；中性粒細胞激活率的增加可以引起中性粒細胞-內皮細胞粘附顯著增加，當切應力由小變大時，這種作用有減緩的趨勢。以上結果提示：
①體內血流產生的切應力可能是阻止中性粒細胞-內皮細胞粘附的重要因素，中性粒細胞粘附隨切應力增加而減少有利于體內正常血液循環的維持；
②中性粒細胞激活可以增加其對內皮細胞的粘附。
關鍵詞：中性粒細胞；激活；粘附；甲酰甲硫亮氨酰苯丙氨酸；人臍靜脈內皮細胞
許多研究結果表明白細胞(尤其是中性粒細胞)激活，以及白細胞與內皮細胞的相萬作用，在心腦血管疾病的發生、發展過程中起著重要作用。但是，國內外現階段只局限于單獨研究白細胞的激活或白細胞與內皮細胞的相互作用，而把白細胞激活結合白細胞-內皮細胞粘附研究的報道尚未見到。為此，我們從細胞流變學角度探討中性粒細胞激活與中性粒細胞-內皮細胞粘附的相關性，以期進一步闡明中性粒細胞-內皮細胞相互作用的機理，探討腦血管疾病的發病機理。
1實驗材料與方法
1．1實驗材料
1．1．1主要試劑
胰蛋白酶(Sigma公司)，M199培養液(GibicoBRL)，膠原酶(Sigma公司)，甲酰甲硫亮氨酰苯丙氨酸(fMLP)(Sigma公司)，硝基藍四唑(NBT)(Fluka AG)，淋巴細胞分離液(比重1．077，上海試劑二廠)。
1．1．2實驗裝置
參見文獻。
1．2實驗方法
1．2．1胎兒臍靜脈內皮細胞的培養及鑒定
按Jaffe等的方法培養原代胎兒臍靜脈內皮細胞(圖1)。細胞長滿并融合為單層時進行消化傳代，接種于22×11mm2蓋玻片上。透射電鏡下胞漿有內皮細胞特異性的Weibel-Palade小體(圖2)。
1．2．2中性粒細胞懸液的制備
將健康人血(肝素抗凝，201U/ml)低速離心棄去富血小板血漿，余血用右旋糖酐Dexrran200沉降紅細胞，將上層細胞懸液置于淋巴細胞分離液(比重1．077)上，離心后取底部細胞并用0．2％NaCl破壞混雜的紅細胞，再用Hanks液清洗二遍后，懸浮于含2％小牛血清的Hanks液中，并調至2×106/ml。分類計數中性粒細胞占95％以上，細胞完整，臺盼藍試驗表明99％為活細胞。
1．2．3中性粒細胞激活的測定
加0．2ml中性粒細胞懸液于干凈、硅化的小塑料試管中，再加等量的0．1％NBT溶液，然后在37℃孵育20分鐘，接著在室溫(22℃)靜置10分鐘，取底部細胞涂片、瑞氏染色，在×100倍油鏡下計數100個中性粒細胞，其中胞漿有藍黑色從(formazan)沉淀者為NBT陽性(激活)中性粒細胞。由此可計算出激活中性粒細胞的百分率。
1．2．4實驗分組
實驗分為對照組、10[-9]mol/L fMLP組(Ⅰ)、10[-8]mol/LfMLP組(Ⅱ)、10[-7]mol/L fMLP組(Ⅲ)，共四組。每組各10例(見附表)。
1．2．5實驗操作
各實驗組在中性粒細胞懸液加入Hanks液或fMLP后，孵育15分鐘，取少量做NBT染色，以測定中性粒細胞的激活率。剩余的中性粒細胞懸液用作粘附特性測定。
將長有內皮細胞的蓋玻片放入流室內并密封，緩慢注入經上述處理后的中性粒細胞懸液。在37℃5％CO2孵箱孵育20分鐘后，取出并安裝到顯微鏡操作臺上。用M199培養液(含2％的新生小牛血清)，以0．05Pa的切應力作用10分鐘以沖走未粘附的中性粒細胞，再依次用0．1、0．15、0．2、0．25、0．5、1．0Pa切應力分別作用2分鐘，觀察并錄像。分別計數各組在不同切應力條件卜中性粒細胞與內皮細胞粘附的數目(取10個隨機視野的平均數)，并求得粘附百分率，即：
1．2．6統計學處理
所得數據作多個樣本均數的F檢驗，并以q檢驗作兩兩比較。
2結果
2．1 fMLP對中性粒細胞激活的影響
不同濃度的fMLP對中性粒細胞激活的影響情況見圖3。
由圖3可見，隨著fMLP濃度的增加，中性粒細胞激活率也增加，二者有顯著的量效關系。對照組的中性粒細胞激活率明顯低于其它三組(P<0．01)，而fMLP三個不同濃度組之間差異均有顯著性(P<0．01)。
2．2 fMLP對中性粒細胞-內皮細胞粘附率的影響
不同切應力下不同濃度的fMLP對中性粒細胞與內皮細胞粘附的影響情況見圖4。由圖4可見，加入fMLP各組較對照組的粘附率增加，有顯著性差異(P<0．01)，Ⅲ組(fiMLP=10[-7]mol/L)較Ⅰ組(fMLP=10-9mol/L)和Ⅱ組(fMLP=10-8mol/L)中性粒細胞粘附率顯著增加(P<0．01)。
根據圖4，對實驗數據進行曲線擬合有如方程：
式中Y為中性粒細胞粘附率(％)，X為切應力(％)。
上述四式可概括為Y=e（a-bx），則a、b為粘附特征常數。
由此可以看出，隨著切應力增大，各組中性粒細胞粘附率呈指數曲線下降。若以0．05Pa切應力剪切后粘附的中性粒細胞數為100％，則可得出切應力與中性粒細胞相對粘附率的關系(圖5)，隨著切應力增大，中性粒細胞相對粘附率逐漸下降，各組均在0．05～0．25Pa段下降較快，以后下降速度減慢。由圖5可得出使粘附的中性粒細胞數減少一半的切應力四組分別為0．17Pa、0．25Pa、0．30Pa、0．35Pa。
2．3中性粒細胞激活率與中性粒細胞-內皮細胞粘附率的關系
對實驗數據進行線性回歸，可以獲得中性粒細胞激活率與中性粒細胞-內皮細胞粘附率的關系圖(圖6所示)。由圖中可見，隨著中性粒細胞激活率的增加，中性粒細胞粘附率呈直線增加。
三條直線分別代表如下回歸方程：
0．05Pa：Y＝9．6601+0．5154X r=0．9913
0．25Pa：Y=1．8951+0．4645X r=0．9957
1．00Pa：Y=0．4034+0．2435X r=0．9991
式中Y為中性粒細胞-內皮細胞粘附率(％)，X為中性粒細胞激活率(％)。
3討論
從本實驗結果可以看出，隨著fMLP濃度的增加，中性粒細胞激活率顯著增加，fMLP是一種強力化學趨化肽，它被證明能誘導中性粒細胞表面CD11/CD18表達，屬速發反應。
本實驗中不管是對照組還是三種不同濃度fMLP組均存在著這種現象，隨著切應力加大，中性粒細胞與內皮細胞的粘附呈指數曲線減少。這一實驗結果與Lawrence等及Kuijper等報道一致，提示體內切應力比較低的毛細血管后微靜脈和小靜脈是中性粒細胞易粘附的部位，而體內血流產生的切應力可能是阻止中性粒細胞與內皮細胞粘附的重要因素，粘附隨切應力增加而減少有利于機體正常血液循環的維持。
本文用經驗公式來表達切應力與中性粒細胞粘附率的關系，找出粘附特征參數a、b值。a值與初始粘附有關，b值與切應力從小變大時中性粒細胞粘附減少的速率有關。a、b值能反映不同條件下中性粒細胞-內皮細胞粘附的特征。對照組初始粘附值較小，而當切應力從小變大時，其中性粒細胞粘附減少速率快。而Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組初始粘附值均比對照組大，當切應力由小變大時，中性粒細胞粘附減少速率比對照組慢。
我們的實驗還觀察到，中性粒細胞激活率的增加，可以引起顯著的中性粒細胞-內皮細胞粘附增加，而在比較高的切應力下中性粒細胞-內皮細胞粘附隨中性粒細胞激活率增高而增加的速率有減緩趨勢，這主要表現在高切應力下的中性粒細胞激活-粘附直線的斜率變小。這說明了切應力對于減少粘附的重要作用。
基金項目：國家自然科學基金資助項目(批準號：39670202)
作者單位：馮興民(華西醫科大學附屬第一醫院臨床微循環實驗室)
陳槐卿(華西醫科大學生物醫學工程研究室成都610041)