相關(guān)論壇
張震宇劉偉楊衛(wèi)良畢鄭鋼
哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科
摘要：
目的：
研究缺血性損傷和缺血再灌注損傷的發(fā)生情況和病理改變，探討細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因p53、p21、Bax、Bcl-2的表達(dá)規(guī)律。
方法：
建立大鼠后肢缺血和缺血再灌注實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，光鏡下觀察缺血和缺血再灌注早期的骨骼肌組織病理學(xué)變化，檢測(cè)缺血和缺血再灌注過(guò)程中細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生及相關(guān)基因p53、p21、Bax、Bcl-2的表達(dá)。
結(jié)果：
缺血5h的大鼠骨骼肌全部存活，而缺血9h者未獲存活。缺血和缺血再灌注損傷引起骨骼肌細(xì)胞水腫、壞死和細(xì)胞凋亡，并于再灌注過(guò)程觀察到微循環(huán)障礙和中性粒細(xì)胞趨化浸潤(rùn)現(xiàn)象。缺血7h細(xì)胞凋亡率更高，相關(guān)基因p53、p21、Bax表達(dá)與缺血時(shí)間成正比，而B(niǎo)cl-2表達(dá)與缺血時(shí)間成反比。
結(jié)論：
細(xì)胞凋亡是缺血和缺血再灌注損傷的重要病理學(xué)改變。
微循環(huán)障礙和中性粒細(xì)胞趨化浸潤(rùn)是缺血再灌注損傷的重要原因之一。
相關(guān)基因表達(dá)與凋亡的發(fā)生關(guān)系密切。
肌肉組織缺血再灌注損傷是近年研究的熱點(diǎn)之一，但多集中在心肌等平滑肌的研究，對(duì)骨骼肌的研究較少。本研究試圖通過(guò)對(duì)骨骼肌不同缺血時(shí)段缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡指數(shù)及相關(guān)基因表達(dá)的監(jiān)測(cè)，探討骨骼肌缺血再灌注損傷后基因調(diào)控的規(guī)律及其生物學(xué)意義。
材料與方法
一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組
健康Wistar大鼠40只[由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供，許可證號(hào)：SYXK(黑)2006-023]，體質(zhì)量250～300s，雌雄不限，清潔級(jí)。隨機(jī)取其中8只為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，另32只，隨機(jī)分為4組，每組8只，做缺血再灌注動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，根?jù)缺血時(shí)間3h、5h、7h、9h分別稱為3h組、5h組、7h組、9h組，各組再灌注時(shí)間均為3h。
二、試劑
細(xì)胞凋亡試劑盒、小鼠抗p21、p53，Bax、Bcl-2蛋白抗體、SABC試劑盒均購(gòu)白武漢博士德公司。
三、大鼠缺血再灌注模型建立方法
根據(jù)Gaines等的方法改進(jìn)，大鼠以體積百分比為0．5％的戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉。于股骨中段水平切斷所有股部肌肉至股骨，保留股動(dòng)靜脈、股神經(jīng)及坐骨神經(jīng)。實(shí)驗(yàn)組于室溫(20℃左右)以微血管夾夾閉股動(dòng)靜脈，每1h變換夾閉部位，達(dá)到預(yù)期缺血時(shí)間后，放松微血管夾，形成再灌注，灌注3h，縫合肌肉及皮膚。對(duì)照組不夾閉股動(dòng)靜脈，僅離斷肌肉，取材后原位縫合肌肉。術(shù)后大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)。
四、組織取材方法
實(shí)驗(yàn)組大鼠，缺血3、5、7、9h再灌注3h后各時(shí)間點(diǎn)分別取材，取大鼠小腿后群肌0．5cm×0．5cm×0．5cm大小肌肉組織。
對(duì)照組離斷肌肉組織后當(dāng)時(shí)及其后3、5、7、9h分別取材，取大鼠小腿后群肌0．5cm×0．5cm×0．5cm大小肌肉組織。
標(biāo)本采用手術(shù)后切除的石蠟包埋組織。4μm連續(xù)切片，分別用于HE染色和免疫組化染色。
五、術(shù)中術(shù)后大體觀察指標(biāo)
缺血模型建立后觀察皮膚顏色、肌肉斷端滲血、末梢血液循環(huán)，以判斷是否實(shí)現(xiàn)缺血。
缺血再灌注模型建立后，觀察皮膚顏色、肌肉斷端滲血、末梢血運(yùn)、動(dòng)脈搏動(dòng)、靜脈回流和充盈，以判斷去除微血管夾后的血運(yùn)恢復(fù)情況。
術(shù)后觀察后肢的皮膚顏色、末梢血液循環(huán)，以判斷成活情況。
六、檢測(cè)方法
取缺血3、5、7、9h再灌注3h后各時(shí)間點(diǎn)的骨骼肌組織，檢測(cè)骨骼肌組織細(xì)胞凋亡情況和p53、p21、Bax、Bcl-2的表達(dá)。
1．細(xì)胞凋亡的檢測(cè)：
采用武漢博士德公司的細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。應(yīng)用原位DNA斷裂位點(diǎn)的3’-基末端標(biāo)記法(TUNEL法)，DAB顯色，之后用蘇木素液輕度復(fù)染，脫水，二甲苯透明，封固切片。
2．p53、p21、Bak、Bcl-2的檢測(cè)：
4μm厚切片，60℃烤片3h，SABC法免疫組化染色技術(shù)，之后用蘇木素液輕度復(fù)染，脫水，二甲苯透明，封固切片。
七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
所有數(shù)據(jù)采用SPSS11．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，計(jì)量資料采用x±s表達(dá)，相關(guān)基因比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，凋亡率比較采用X2檢驗(yàn)，P＜0．05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果
一、術(shù)中、術(shù)后的大體觀察結(jié)果
缺血5h以內(nèi)的骨骼肌全部成活，末梢痛覺(jué)保存較好；缺血7h的8只大鼠中4只后肢漸變?yōu)樽虾谏?，終壞死，4只大鼠后肢存活，但末梢痛覺(jué)不良；所有缺血9h的肢體，皮膚終漸變?yōu)樽虾谏?，無(wú)存活，解剖股動(dòng)靜脈主干無(wú)明顯血栓形成。
二、組織學(xué)觀察結(jié)果
再灌注3h內(nèi)，連續(xù)觀察HE染色組織玻片，可見(jiàn)明顯的缺血再灌注損傷出現(xiàn)。以缺血3h再灌注3h，近60％的肌細(xì)胞出現(xiàn)空泡，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到血管外，肌膜周邊可見(jiàn)浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞。缺血3h與5h的肌組織缺血再灌注后病理變化規(guī)律相似，損傷明顯，而缺血7h和缺血9h的肌組織再灌注后病理變化雖有相似，但程度較弱，肌細(xì)胞水腫加重程度較輕，空泡形成數(shù)量和中性粒細(xì)胞貼壁浸潤(rùn)數(shù)量也較少(圖1，2)。
三、細(xì)胞凋亡及p53、p21、Bax、Bcl-2的表達(dá)
正常骨骼肌和缺血3h以內(nèi)未檢測(cè)到凋亡細(xì)胞，缺血5h再灌注3h，凋亡率顯著升高(X2=3．861，P＜0．01)，缺血7h再灌注3h達(dá)到高峰，凋亡率隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而升高，升高幅度較小。凋亡率、p53、p21、Bax的表達(dá)，缺血3h組與5h組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q分別為3．873、3．867、3．914、3．933，P＜0．01)；缺血5h組與7h組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q分別為3．923、3．871、3．848、3．972，P＜0．01)。Bcl-2的表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，明顯下降。各時(shí)間點(diǎn)凋亡率及p53、p21，Bax、Bcl-2的表達(dá)見(jiàn)表1(圖3～7)。
討論
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制得到了一定的闡明，先后發(fā)現(xiàn)caspase、Bcl-2、p53等很多基因都與細(xì)胞凋亡有著重要關(guān)系，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了多種引導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)引導(dǎo)途徑。對(duì)肌組織缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的研究多集中在平滑肌上，對(duì)骨骼肌研究報(bào)道較少。
有研究表明，再灌注早期骨骼肌細(xì)胞凋亡率明顯升高。骨骼肌的再灌注過(guò)程中，從3～9h時(shí)都造成了p53和p21 WAF-1的累積增加。許多研究已經(jīng)證明，活化的多形核白細(xì)胞(中性粒)和氧自由基在缺血再灌注過(guò)程中的骨骼肌損傷起著重要的作用。再灌注過(guò)程中產(chǎn)生的氧自由基能造成DNA損害，激發(fā)由p53和p21 WAF-1介導(dǎo)的一系列細(xì)胞反應(yīng)。p53的增長(zhǎng)程度與細(xì)胞對(duì)DNA損害的反應(yīng)直接相關(guān)，可以通過(guò)p21WAF-1下游因子的增量調(diào)節(jié)來(lái)影響細(xì)胞周期停滯和凋亡。一般情況下，細(xì)胞周期停滯是由p21WAF-1的活化來(lái)誘導(dǎo)的。從3h到9h，Bcl-2的表達(dá)逐漸下降，當(dāng)p53和p21WAF-1的表達(dá)至高時(shí)Bcl-2的表達(dá)降到至低。線粒體損傷也可能是缺血再灌注誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要因素。Bcl-2主要分布于線粒體膜上，組成線粒體膜的孔和道，對(duì)于維持線粒體的正常功能、控制凋亡因子的外溢有著非常重要的意義。
缺血3～5h，Bax蛋白的水平和細(xì)胞的凋亡率有所增加，但增幅較小。雖然再灌注后p53和p21WAF-1的表達(dá)率逐漸升高，但缺血3h組的p53表達(dá)率高于p2lWAF-1的表達(dá)率。這個(gè)結(jié)果可能說(shuō)明p53可活化p21 WAF-1，并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，凋亡是由Bax蛋白的活化來(lái)誘導(dǎo)的。我們認(rèn)為，缺血3～5h由p53和P21WAF-1累積來(lái)誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制是提供時(shí)間以修復(fù)損傷的DNA。此時(shí)Bcl-2的表達(dá)還維持在一個(gè)較高的水平。表明Bcl-2蛋白可抑制p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Bcl-2還可通過(guò)：
①抑制鈣離子的釋放；
②抗氧化劑作用；
③保持線粒體膜的穩(wěn)定性，抑制細(xì)胞色素c和凋亡誘導(dǎo)因子的釋放。此時(shí)Bcl-2/Bax是1．3：1．0。
缺血7h，p53和p21 WAF-1仍在累積，在開(kāi)始增長(zhǎng)時(shí)間和高峰時(shí)間方面；p21 WAF-1和Bax的變化與p53類似。Bcl-2的表達(dá)下降到較低水平，說(shuō)明p53活化了Bax蛋白。細(xì)胞凋亡被誘導(dǎo)產(chǎn)生了，此時(shí)凋亡率更高。此時(shí)Bcl-2/Bax是0．6：1．0。Bcl-2/Bax的比例是決定細(xì)胞生死存亡的變阻器，當(dāng)細(xì)胞接受某些刺激信號(hào)后，如果Bcl-2過(guò)表達(dá)，形成Bcl-2/Bax異二聚體增加，細(xì)胞免于凋亡；如果Bax高表達(dá)，形成Bax/Bax同二聚體增加，細(xì)胞發(fā)生凋亡。
本研究中p53與p21 WAF-1各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)接近，說(shuō)明p21 WAF-1可以以一種非p53誘導(dǎo)的方式活化，p21 WAF-1的活化和細(xì)胞凋亡可以同時(shí)發(fā)生，暗示p21 WAF-1與細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡都有關(guān)。Didenko等指出低水平的DNA損傷產(chǎn)生了一個(gè)生長(zhǎng)停止信號(hào)：p21 WAF-1使之修復(fù)損害，高水平的損害觸發(fā)了細(xì)胞凋亡反應(yīng)，即使在那些已經(jīng)誘導(dǎo)活化p21WAF-1的細(xì)胞里也發(fā)生了細(xì)胞凋亡。
組織病理學(xué)研究顯示7h后的損傷遠(yuǎn)比3h時(shí)嚴(yán)重，DNA損害也類似。9hp53、p21 WAF-1和Bax的表達(dá)率達(dá)到至高；Bcl-2表達(dá)率至低，凋亡率無(wú)明顯增高。這說(shuō)明7h時(shí)，DNA已經(jīng)損害，而且是不可逆的損害，缺血7h前的藥物及手術(shù)是有效的，7h后藥物和手術(shù)可能就無(wú)能為力了。對(duì)于缺血再灌注損傷更應(yīng)注重早期診斷和早期治療。
本研究結(jié)果顯示大鼠肢體缺血再灌注隨著細(xì)胞凋亡的增加，p53、p21、Bax的表達(dá)明顯上升，Bcl-2的表達(dá)明顯下降，且都在7h時(shí)達(dá)到至大，說(shuō)明p53、p21、Bax、Bcl-2的表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡、缺血再灌注損傷密切相關(guān)，提示針對(duì)這些分子的特異治療有可能在某種程度上影響缺血再灌注的進(jìn)程，這種治療應(yīng)在缺血7h內(nèi)進(jìn)行。而p53、p21、Bax、Bcl-2的檢測(cè)亦有可能作為早期肢體缺血再灌注的參考指標(biāo)。