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作者：秦瑞峰顧曉明秦曉春
《第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)》2001年01期
【作者單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院頜面外科!陜西西安710033
第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院頜面外科!陜西西安710033
黑龍江省龍江廣厚醫(yī)院
摘要：
目的：
對(duì)骨骼肌分化中的凋亡現(xiàn)象進(jìn)行初步研究。
方法：
本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的C2C12肌母細(xì)胞分化模型，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)肌細(xì)胞分化過(guò)程中細(xì)胞周期的變化，提取細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行電泳分析，用原位末端標(biāo)記法進(jìn)行了凋亡細(xì)胞染色，電子顯微鏡觀察凋亡小體的形成。
結(jié)果：
C2C12細(xì)胞在肌分化誘導(dǎo)24h和48h，檢測(cè)出凋亡現(xiàn)象；而對(duì)照組、肌分化誘導(dǎo)72h組均未檢出凋亡現(xiàn)象。
結(jié)論：
在肌肉分化、發(fā)育的過(guò)程中，某些細(xì)胞會(huì)按自身程序主動(dòng)死亡，以凋亡細(xì)胞的形式排除，而且具有明顯的時(shí)間性，終末分化的肌管不易出現(xiàn)凋亡。
0引言
細(xì)胞凋亡近年來(lái)已成為細(xì)胞生物學(xué)研究的新領(lǐng)域，它作為一種細(xì)胞生理性的死亡方式，在維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用。凋亡現(xiàn)象的研究方法很多，形態(tài)上表現(xiàn)為細(xì)胞固縮、染色體凝集并向核膜靠攏，終形成新月?tīng)钚◇w；其生化學(xué)特征則是DNA在核酸電泳時(shí)呈梯級(jí)格局。凋亡概念的提出為研究胚胎發(fā)生、發(fā)展、個(gè)體形成、器官的細(xì)胞平衡增添了新的內(nèi)容，指導(dǎo)醫(yī)學(xué)實(shí)踐。骨骼肌肌母細(xì)胞分化發(fā)育，先必須退出細(xì)胞增殖周期，在多種因子的調(diào)節(jié)下，融合成具有多核的肌管結(jié)構(gòu)。C2C12是小鼠骨骼肌肌母細(xì)胞，20mL·L-1胚牛血清的DMEM培養(yǎng)基可誘導(dǎo)其分化，且骨骼肌細(xì)胞分化過(guò)程中DNA的合成以及細(xì)胞周期發(fā)生明顯變化。我們采用C2C12細(xì)胞模型，對(duì)骨骼肌分化中的凋亡現(xiàn)象進(jìn)行初步研究，以闡述機(jī)體骨骼肌發(fā)生、發(fā)育中肌細(xì)胞的凋亡作用，從而為進(jìn)一步研究骨骼肌損傷后再生的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。
1材料和方法
1.1材料
C2C12細(xì)胞（澳大利Proton教授惠贈(zèng)），調(diào)整細(xì)胞密度至5×105·L-1，接種于100mL·L-1胚牛血清的DMEM（Hyclone）培養(yǎng)基中，在50mL·L-1 CO2孵育箱培養(yǎng)（37℃）。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為生長(zhǎng)培養(yǎng)基GM（100mL·L-1胚牛血清的DMEM），實(shí)驗(yàn)組改變?yōu)榉只囵B(yǎng)基DM（20mL·L-1胚牛血清的DMEM），分別24、48和72h換為分化培養(yǎng)基的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.2方法
1.2.1流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞的檢測(cè)
按文獻(xiàn)，分別取4組細(xì)胞試驗(yàn)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106mL-1，4℃PBS洗滌，700mL·L-1冷乙醇固定，上機(jī)前PBS洗滌細(xì)胞，加50μg mL-1碘化丙啶，1mL·L-1Triton X-100，0.1mmol·L-1EDTA（Na）2，50μg mL-1Rnase，4℃染色30min樣品300目尼龍膜過(guò)濾，488nm氬激光激發(fā)，>610nm濾色片檢測(cè)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。
1.2.2 TUNEL法
按原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)盒（德國(guó)寶靈曼）程序進(jìn)行。常規(guī)細(xì)胞爬片，20μg·mL-1蛋白酶K消化30min，洗3遍，滴加TUNEL反應(yīng)液，37℃，60min，振洗后加入convert-AP，37℃，60min，之后滴加底物顯色液，10min終止反應(yīng)，封片，光鏡下分析。凋亡細(xì)胞的胞核呈現(xiàn)紫藍(lán)色，未凋亡細(xì)胞的胞核不著色。
1.2.3電鏡檢測(cè)
常規(guī)方法制作透射電鏡標(biāo)本，用TEM-200EX透射電鏡觀察。
1.2.4 DNA的電泳分析
細(xì)胞經(jīng)2.5g·L-1胰酶消化，800min，離心5min收集細(xì)胞，48h漂浮細(xì)胞直接從培養(yǎng)液中離心收集。隨之提取各組細(xì)胞基因組DNA做電泳分析，在50V，30mA下，用20g·L-1瓊脂糖電泳2h，EB染色30min，紫外燈下觀察、拍照記錄。
2結(jié)果
2.1肌細(xì)胞分化過(guò)程中細(xì)胞周期
C2C12肌細(xì)胞分化培養(yǎng)基培養(yǎng)48h的細(xì)胞周期分析中，可見(jiàn)凋亡峰，在圖中位于單倍體和二倍體峰之間（Fig1）。
2.2形態(tài)學(xué)觀察和TUNEL法染色
光鏡下觀察，C2C12肌細(xì)胞GM培養(yǎng)24h可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞，胞核呈紫藍(lán)色，GM誘導(dǎo)48h凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，存活細(xì)胞部分開(kāi)始融合。對(duì)照組、GM誘導(dǎo)培養(yǎng)72h組均未見(jiàn)凋亡細(xì)胞，后者肌細(xì)胞融合形成的肌管增多，肌管內(nèi)含多個(gè)胞核的分化現(xiàn)象（Fig2）。
2.3電鏡觀察
GM誘導(dǎo)培養(yǎng)24h和48h的C2C12肌細(xì)胞中，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞核漿比例增大，核片段聚集成塊堆聚在核膜周?chē)‵ig3）。
2.4細(xì)胞基因組DNA的電泳分析
肌細(xì)胞于分化培養(yǎng)基培養(yǎng)24h、細(xì)胞出現(xiàn)梯狀DNA，尤以48h懸浮細(xì)胞顯著（Fig4）。
3討論
迄今已發(fā)現(xiàn)許多因素都可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，生化機(jī)制還不十分明確。一般認(rèn)為程序化細(xì)胞死亡過(guò)程中核DNA的降解是由于一種Ca2+，Mg2+依賴性內(nèi)切酶活化引起的。多細(xì)胞有機(jī)體的發(fā)生、發(fā)育有賴于細(xì)胞增殖、分化和死亡的精密結(jié)合，即細(xì)胞周期的正常運(yùn)行，細(xì)胞的增殖和凋亡的平衡。對(duì)肌肉細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的研究將對(duì)揭示肌細(xì)胞惡變、老化、退變性肌病等的發(fā)病機(jī)制及其治療有重要意義。
FCM是檢測(cè)細(xì)胞凋亡有效而靈敏的方法，為觀察凋亡提供了新的手段；凋亡細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)TUNEL法，是利用凋亡細(xì)胞生化特征的先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)，具有很高的靈敏性。本實(shí)驗(yàn)中肌細(xì)胞分化的特定時(shí)期即肌母細(xì)胞在分化培養(yǎng)基培養(yǎng)24h和48h，TUNEL法染出了凋亡細(xì)胞，此外，DNA凝膠電泳分析出現(xiàn)反映核小體斷裂的DNA梯狀帶。以上結(jié)果表明，在肌肉分化、發(fā)育的過(guò)程中，某些細(xì)胞會(huì)按自身程序主動(dòng)死亡，以凋亡細(xì)胞的形式排除，這在肌肉組織重建有積極的意義。另外，凋亡的發(fā)生具有明顯的時(shí)間性，分化早期（24h）檢測(cè)出凋亡細(xì)胞數(shù)量較少，可能原因是此期間為特異性基因開(kāi)放期，分子水平反映活躍，形態(tài)改變不太顯著；分化后期（72h）不再發(fā)生凋亡，主要原因在于誘導(dǎo)72h后肌母細(xì)胞已經(jīng)融合形成肌管，肌管是終末分化的肌細(xì)胞，不能再進(jìn)入細(xì)胞分裂周期。不過(guò)，近期有的學(xué)者SV40大抗原引入肌管，終末分化的肌管重新進(jìn)入細(xì)胞周期，出現(xiàn)減數(shù)分裂和凋亡，說(shuō)明肌管仍具有凋亡發(fā)生的機(jī)制。
細(xì)胞凋亡時(shí)伴有多種基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。c-myc是調(diào)控細(xì)胞增殖的主要基因，c-myc的表達(dá)產(chǎn)物是一種轉(zhuǎn)錄因子，與細(xì)胞增殖分化及癌變有密切關(guān)系。Evan等選用大鼠成纖維細(xì)胞Rat1/myc為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯堪l(fā)現(xiàn)，當(dāng)有某些因素（低血清濃度，抑制細(xì)胞周期因子，抑癌基因）存在時(shí)c-myc基因的表達(dá)與細(xì)胞程序性死亡密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在誘導(dǎo)肌細(xì)胞分化時(shí)采用20mL·L-1血清的DMEM培養(yǎng)基，c-myc可能在細(xì)胞的凋亡方面起了很重要作用，c-myc的調(diào)節(jié)過(guò)程的機(jī)制仍很不清楚。總之，肌母細(xì)胞分化、發(fā)育的過(guò)程中出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象可能為保證肌肉發(fā)育成熟所必須，為清除不再需要的肌細(xì)胞提供了一個(gè)有效機(jī)制，它的研究對(duì)于肌肉系統(tǒng)疾病認(rèn)識(shí)將有很大幫助。